ISO 10993-5 | آزمون سمیت سلولی تجهیزات پزشکی

استاندارد ISO 10993-5 یکی از مهم‌ترین استانداردهای ارزیابی زیستی تجهیزات پزشکی است که به آزمون‌های سمیت سلولی در شرایط in vitro (In Vitro Cytotoxicity) اختصاص دارد. هدف این استاندارد، ارزیابی پاسخ سلول‌های پستانداران در تماس با یک وسیله پزشکی، مواد تشکیل‌دهنده آن یا عصاره‌های حاصل از محصول است.

سمیت سلولی یکی از نقاط پایانی مهم در ارزیابی زیستی تجهیزات پزشکی است؛ زیرا مواد، افزودنی‌ها، مواد قابل استخراج یا مواد آزادشده از یک محصول می‌توانند در شرایط استفاده موردنظر بر زنده‌مانی و عملکرد سلول‌ها اثر منفی داشته باشند.

در ISO 10993-5 روش‌هایی برای تماس سلول‌های کشت‌شده با وسیله پزشکی یا عصاره آن، به‌صورت مستقیم، از طریق عصاره یا با روش انتشار، مورد توجه قرار گرفته‌اند.

Reagent dispensing for MTT assay workflow | INTEGRA

ISO 10993-5 برای چه محصولاتی کاربرد دارد؟

آزمون سمیت سلولی می‌تواند برای ارزیابی طیف گسترده‌ای از تجهیزات پزشکی و مواد مورد استفاده در ساخت آن‌ها مطرح باشد؛ از جمله:

  • مواد پلیمری و پلاستیکی
  • کاتترها و لوله‌های پزشکی
  • ایمپلنت‌ها
  • مواد دندانپزشکی
  • پوشش‌ها و مواد سطحی
  • چسب‌های پزشکی
  • مواد مورد استفاده در پانسمان
  • محصولات یک‌بارمصرف پزشکی
  • تجهیزات دارای تماس با بافت یا سلول
  • مواد و محصولات استریل‌شده
  • مواد قابل استخراج و مواد آزادشده از تجهیزات پزشکی

با این حال، قرار گرفتن محصول در یکی از این گروه‌ها به‌تنهایی به معنی الزام به انجام آزمون نیست. ضرورت آزمون باید در چارچوب فرآیند ارزیابی زیستی و مدیریت ریسک تعیین شود.

هدف آزمون سمیت سلولی ISO 10993-5 چیست؟

در آزمون cytotoxicity، هدف اصلی بررسی این موضوع است که آیا ماده یا محصول مورد ارزیابی می‌تواند تحت شرایط آزمون، اثر نامطلوب قابل توجهی بر سلول‌های کشت‌شده پستانداران ایجاد کند یا خیر.

این اثرات می‌توانند از طریق شاخص‌های مختلفی ارزیابی شوند؛ برای مثال:

  • کاهش زنده‌مانی سلول‌ها
  • تغییر مورفولوژی سلول
  • آسیب یا مرگ سلولی
  • کاهش فعالیت متابولیک
  • تغییر در رشد و تکثیر سلولی

بنابراین، آزمون سمیت سلولی صرفاً مشاهده سلول زیر میکروسکوپ نیست و بسته به روش انتخابی می‌توان از شاخص‌های کمی یا کیفی برای ارزیابی پاسخ سلولی استفاده کرد.

روش‌های اصلی ارزیابی سمیت سلولی

ISO 10993-5 سه رویکرد اصلی برای تماس ماده یا محصول با سلول‌ها را در نظر می‌گیرد:

۱. آزمون تماس مستقیم (Direct Contact)

در روش Direct Contact، نمونه یا بخش مناسب از ماده مستقیماً در تماس با لایه سلولی قرار می‌گیرد.

این روش برای موادی که بتوان آن‌ها را بدون ایجاد شرایط نامناسب برای کشت سلولی روی سلول‌ها قرار داد، قابل استفاده است.

پس از دوره تماس، پاسخ سلول‌ها بررسی می‌شود.

۲. آزمون استخراجی (Extract Method)

در روش استخراجی، ابتدا نمونه تحت شرایط مشخص با یک محیط استخراج مناسب قرار می‌گیرد و سپس عصاره حاصل برای تماس با سلول‌های کشت‌شده استفاده می‌شود.

این روش از این جهت اهمیت دارد که ممکن است یک ماده جامد در تماس مستقیم با سلول قرار نگیرد، اما ترکیباتی از آن در محیط آزاد شوند که بتوانند اثر سیتوتوکسیک ایجاد کنند.

به همین دلیل، انتخاب شرایط استخراج باید با توجه به ویژگی محصول و هدف ارزیابی انجام شود.

۳. روش انتشار (Diffusion)

در روش انتشار، نمونه به نحوی نسبت به لایه سلولی قرار می‌گیرد که ترکیبات قابل انتشار بتوانند از طریق یک واسطه مناسب به سلول‌ها برسند.

این روش در مقایسه با تماس مستقیم، امکان بررسی اثر موادی را فراهم می‌کند که تماس مستقیم آن‌ها با سلول ممکن است مناسب نباشد.

Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy | Nano Convergence | Springer Nature Link

آزمون MTT و ISO 10993-5

یکی از روش‌های متداول برای ارزیابی سمیت سلولی، استفاده از آزمون‌های مبتنی بر فعالیت متابولیک سلول است. آزمون MTT یکی از شناخته‌شده‌ترین روش‌ها در این زمینه است.

در آزمون MTT، فعالیت متابولیک سلول‌ها به‌عنوان شاخصی برای ارزیابی وضعیت سلولی اندازه‌گیری می‌شود. کاهش سیگنال حاصل از آزمون می‌تواند نشان‌دهنده کاهش فعالیت متابولیک یا کاهش تعداد سلول‌های زنده باشد.

اما یک نکته مهم وجود دارد:

ISO 10993-5 را نباید معادل «آزمون MTT» دانست.

استاندارد یک روش واحد مانند MTT را به‌عنوان تنها روش آزمون تعیین نمی‌کند؛ بلکه چارچوب روش‌های ارزیابی سمیت سلولی را ارائه می‌دهد. FDA نیز در توضیح دامنه ISO 10993-5 آن را استانداردی برای روش‌های ارزیابی cytotoxicity معرفی می‌کند، نه یک آزمون واحد.

بنابراین روش‌هایی مانند MTT، NRU و سایر روش‌های ارزیابی viability باید بر اساس طراحی آزمون، ویژگی محصول و روش اعتبارسنجی‌شده انتخاب شوند.

چرا انتخاب روش استخراج اهمیت دارد؟

در آزمون‌های استخراجی، نتیجه فقط به ماده مورد آزمایش وابسته نیست؛ بلکه شرایط استخراج نیز می‌تواند بر ترکیباتی که وارد عصاره می‌شوند اثر بگذارد.

به همین دلیل، مواردی مانند:

  • ماهیت ماده
  • شکل و ابعاد نمونه
  • نسبت نمونه به محیط استخراج
  • محیط استخراج
  • دمای استخراج
  • مدت استخراج
  • شرایط استفاده موردنظر

می‌توانند در طراحی آزمون اهمیت داشته باشند.

آماده‌سازی نمونه و مواد مرجع در مجموعه ISO 10993 با ISO 10993-12 مرتبط است و انتخاب شرایط آزمون باید با سایر اطلاعات مربوط به محصول هماهنگ باشد.

سلول مورد استفاده در آزمون ISO 10993-5

در ارزیابی سمیت سلولی تجهیزات پزشکی از سلول‌های پستانداران کشت‌شده استفاده می‌شود.

انتخاب سلول باید با توجه به روش آزمون و هدف ارزیابی انجام شود. یکی از رده‌های سلولی شناخته‌شده در مطالعات cytotoxicity، L-929 است که در بسیاری از روش‌های ارزیابی سمیت سلولی مواد پزشکی مورد استفاده قرار گرفته است.

اما این نکته مهم است که:

استفاده از L-929 به این معنی نیست که تمام محصولات پزشکی الزاماً باید فقط با L-929 آزمون شوند.

انتخاب مدل سلولی باید از نظر علمی و متناسب با کاربرد آزمون توجیه شود.

کنترل‌های آزمون سمیت سلولی

یک آزمون معتبر سمیت سلولی فقط شامل نمونه آزمایشی نیست و به کنترل‌های مناسب نیاز دارد.

به‌طور کلی، طراحی آزمون باید امکان مقایسه پاسخ سلولی در شرایط مناسب را فراهم کند و کنترل‌های مناسب برای بررسی عملکرد سیستم آزمون در نظر گرفته شوند.

کنترل‌های مناسب می‌توانند برای مواردی مانند:

  • کنترل منفی
  • کنترل مثبت
  • بررسی شرایط کشت سلولی
  • کنترل‌های مربوط به روش اندازه‌گیری

در نظر گرفته شوند.

انتخاب ماده کنترل باید با توجه به روش و هدف آزمون انجام شود و نباید یک ماده را بدون توجه به روش آزمایش به‌صورت عمومی به‌عنوان کنترل مناسب معرفی کرد.

تفسیر نتایج آزمون ISO 10993-5

یکی از مهم‌ترین بخش‌های آزمون cytotoxicity، تفسیر صحیح نتیجه است.

نباید صرفاً بر اساس یک عدد یا یک مشاهده میکروسکوپی نتیجه‌گیری کرد که محصول «سمیت دارد» یا «کاملاً ایمن است».

نتیجه باید با توجه به:

  • روش آزمون
  • کنترل‌های آزمون
  • شاخص اندازه‌گیری
  • شرایط تماس
  • شرایط استخراج
  • ویژگی‌های محصول
  • تکرارپذیری نتایج
  • و چارچوب ارزیابی زیستی

تفسیر شود.

همچنین باید توجه داشت که نتیجه یک آزمون in vitro cytotoxicity به‌تنهایی اثبات‌کننده ایمنی زیستی کامل یک وسیله پزشکی نیست.

تفاوت ISO 10993-5 با ISO 10993-3

این دو استاندارد گاهی با یکدیگر اشتباه گرفته می‌شوند، اما نقاط پایانی متفاوتی دارند.

استاندارد موضوع اصلی
ISO 10993-5 سمیت سلولی in vitro
ISO 10993-3 ژنوتوکسیسیته، سرطان‌زایی و سمیت تولیدمثلی و تکاملی

بنابراین cytotoxicity با genotoxicity یکسان نیست.

ممکن است یک ماده در آزمون سمیت سلولی اثر قابل توجهی نشان دهد، اما این نتیجه به‌تنهایی به معنی ژنوتوکسیسیته نیست. به همین ترتیب، نتیجه منفی یک آزمون سمیت سلولی نیز به‌تنهایی نمی‌تواند عدم وجود تمام خطرات ژنتیکی را اثبات کند.

تفاوت ISO 10993-5 با USP 87

استاندارد ISO 10993-5 و آزمون USP <87> Biological Reactivity Tests, In Vitro هر دو در حوزه ارزیابی پاسخ سلولی به مواد پزشکی کاربرد دارند، اما از نظر چارچوب استانداردی نباید بدون بررسی جزئیات، آن‌ها را کاملاً معادل فرض کرد.

برای یک پرونده رگولاتوری، باید مشخص شود که:

  • کدام استاندارد یا روش مورد استناد است؛
  • روش آزمون دقیقاً چگونه اجرا شده؛
  • نمونه چگونه آماده شده؛
  • روش استخراج یا تماس چگونه انجام شده؛
  • و معیار تفسیر نتیجه بر چه مبنایی انتخاب شده است.

FDA در فهرست استانداردهای خود ISO 10993-5:2009 را به‌صورت Complete Recognition شناسایی کرده و همچنین USP <87> را به‌عنوان یک استاندارد جداگانه در حوزه Biocompatibility فهرست کرده است.

ارتباط ISO 10993-5 با ISO 10993-1

ISO 10993-5 نباید به‌صورت جداگانه از فرآیند ارزیابی زیستی محصول تفسیر شود.

در چارچوب ارزیابی زیستی، ابتدا باید مواردی مانند:

نوع وسیله پزشکی → کاربرد موردنظر → محل تماس → مدت تماس → ماهیت مواد → اطلاعات شیمیایی → خطرات زیستی

بررسی شوند.

سپس مشخص می‌شود که آیا ارزیابی سمیت سلولی لازم است و در صورت نیاز، کدام روش برای محصول مناسب‌تر است.

بنابراین، سؤال صحیح صرفاً این نیست که:

«آیا ISO 10993-5 انجام شده است؟»

بلکه باید پرسید:

«آیا ارزیابی سمیت سلولی مناسب برای محصول، با یک روش علمی و قابل دفاع انجام شده است؟»

آیا ISO 10993-5 برای همه تجهیزات پزشکی الزامی است؟

خیر.

این موضوع یکی از مهم‌ترین نکات در استفاده از استاندارد ISO 10993-5 است.

ISO 10993-1 رویکرد ارزیابی زیستی مبتنی بر ریسک را دنبال می‌کند و بنابراین نیاز به آزمون باید بر اساس ویژگی‌های محصول، نوع تماس و شواهد موجود تعیین شود.

در نتیجه، عبارت «برای تمام تجهیزات پزشکی باید تست ISO 10993-5 انجام شود» یک بیان کلی و قابل دفاع رگولاتوری نیست.

ویرایش فعلی ISO 10993-5

در حال حاضر، ISO 10993-5:2009، ویرایش سوم، نسخه جاری منتشرشده توسط ISO است. صفحه رسمی ISO اعلام می‌کند که این استاندارد در سال 2022 بازبینی و تأیید شده و بنابراین همچنان Current است.

عنوان رسمی استاندارد:

ISO 10993-5:2009 — Biological evaluation of medical devices — Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity

FDA نیز این استاندارد را با شناسه شناسایی 2-245 و با میزان شناسایی Complete در فهرست استانداردهای مورد شناسایی خود قرار داده است.

خدمات آزمون ISO 10993-5 در سنجش ساناژن

آزمایشگاه سنجش ساناژن در زمینه ارزیابی زیستی تجهیزات پزشکی و آزمون‌های سمیت سلولی فعالیت می‌کند.

بر اساس ویژگی محصول و روش انتخاب‌شده، ارزیابی سمیت سلولی می‌تواند با استفاده از روش‌های مختلف انجام شود، از جمله:

  • آزمون MTT
  • آزمون Neutral Red Uptake (NRU)
  • آزمون Direct Contact
  • آزمون‌های مبتنی بر Extract
  • ارزیابی مورفولوژی سلولی
  • ارزیابی زنده‌مانی و فعالیت متابولیک سلول‌ها

انتخاب روش نهایی باید متناسب با نوع محصول، هدف آزمون و استراتژی ارزیابی زیستی انجام شود.

سوالات متداول درباره ISO 10993-5

ISO 10993-5 چیست؟

ISO 10993-5 استاندارد مربوط به آزمون‌های سمیت سلولی in vitro تجهیزات پزشکی است و روش‌هایی را برای ارزیابی پاسخ سلول‌های پستانداران در تماس با وسیله پزشکی یا عصاره آن توصیف می‌کند.

آیا ISO 10993-5 همان تست MTT است؟

خیر. MTT یکی از روش‌های متداول برای ارزیابی پاسخ سلولی است، اما ISO 10993-5 را نباید صرفاً به آزمون MTT محدود کرد.

آیا آزمون ISO 10993-5 فقط با L-929 انجام می‌شود؟

خیر. L-929 یک مدل سلولی رایج است، اما انتخاب مدل سلولی باید با توجه به هدف آزمون و روش مورد استفاده توجیه شود.

آیا آزمون Direct Contact و Extract هر دو لازم هستند؟

لزومی ندارد. انتخاب روش به ویژگی محصول و راهبرد ارزیابی بستگی دارد و نمی‌توان یک ترکیب ثابت از آزمون‌ها را برای تمام تجهیزات پزشکی تعیین کرد.

آیا نتیجه منفی cytotoxicity به معنی زیست‌سازگاری کامل محصول است؟

خیر. سمیت سلولی فقط یکی از نقاط پایانی ارزیابی زیستی است و نتیجه منفی آن به‌تنهایی ایمنی زیستی کامل محصول را اثبات نمی‌کند.