آزمون سمیت سلولی Alamar Blue

الزام دریافت تأییدیه برای تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی و دارویی

خلاصه آزمون

زمینه و هدف: ارزیابی سمیت سلولی یکی از مراحل اساسی در بررسی زیست‌سازگاری مواد، تجهیزات پزشکی، محصولات دارویی و فرآورده‌های آرایشی و بهداشتی است. هدف از این ارزیابی، تعیین اثرات احتمالی مواد بر بقا، رشد و عملکرد سلول‌ها در شرایط آزمایشگاهی می‌باشد. آزمون سمیت سلولی Alamar Blue یکی از روش‌های کمی، حساس و پرکاربرد برای سنجش زنده‌مانی سلولی و فعالیت متابولیکی سلول‌ها محسوب می‌شود. این آزمون بر پایه اندازه‌گیری توانایی سلول‌های زنده در انجام واکنش‌های احیایی طراحی شده و امکان ارزیابی سریع و دقیق اثرات مواد مختلف بر عملکرد سلولی را فراهم می‌کند. به دلیل حساسیت بالا، سهولت اجرا و عدم تخریب سلول‌ها در طول آزمایش، این روش به طور گسترده در مطالعات زیست‌سازگاری، توسعه محصولات پزشکی و تحقیقات سلولی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

روش انجام: در تست سمیت سلولی Alamar Blue، ابتدا سلول‌های مناسب در ظروف کشت سلولی تحت شرایط استاندارد رشد داده می‌شوند. پس از رسیدن سلول‌ها به تراکم مناسب، نمونه یا عصاره آزمون در غلظت‌های مختلف به محیط کشت اضافه شده و سلول‌ها برای مدت زمان مشخص در معرض ماده مورد بررسی قرار می‌گیرند. پس از پایان دوره تماس، معرف Alamar Blue به محیط کشت افزوده می‌شود. این معرف حاوی ترکیبی است که توسط سلول‌های زنده و فعال متابولیکی احیا می‌شود. در نتیجه فعالیت متابولیکی سلول‌ها، تغییرات قابل اندازه‌گیری در ویژگی‌های نوری یا فلورسانس محیط ایجاد می‌شود. شدت این تغییرات مستقیماً با تعداد سلول‌های زنده و میزان فعالیت متابولیکی آن‌ها ارتباط دارد. در پایان، مقادیر به‌دست‌آمده توسط دستگاه‌های مناسب اندازه‌گیری شده و درصد زنده‌مانی سلول‌ها نسبت به گروه کنترل محاسبه می‌شود.

یافته‌ها و طبقه‌بندی: کاهش فعالیت متابولیکی و زنده‌مانی سلولی در مقایسه با گروه کنترل نشان‌دهنده وجود اثرات سمی ناشی از ماده مورد آزمون است. هرچه میزان کاهش پاسخ سلولی بیشتر باشد، شدت سمیت سلولی نیز بیشتر ارزیابی می‌شود. نتایج آزمون معمولاً به صورت درصد زنده‌مانی سلولی، درصد مهار رشد و میزان کاهش فعالیت متابولیکی گزارش می‌شوند. طبقه‌بندی نتایج بر اساس مقایسه با گروه کنترل منفی و معیارهای پذیرش تعیین‌شده انجام می‌شود. در صورتی که زنده‌مانی سلولی در محدوده قابل قبول باقی بماند، ماده مورد بررسی فاقد سمیت سلولی قابل توجه تلقی می‌شود. در مقابل، کاهش معنی‌دار فعالیت متابولیکی و زنده‌مانی سلول‌ها نشان‌دهنده وجود اثرات نامطلوب بر عملکرد و بقای سلولی است. بررسی وابستگی پاسخ به غلظت و تکرارپذیری نتایج نیز در تفسیر نهایی اهمیت ویژه‌ای دارد.

نتیجه‌گیری: آزمون سمیت سلولی آلامار بلو یکی از روش‌های معتبر، دقیق و حساس برای ارزیابی زنده‌مانی و فعالیت متابولیکی سلول‌ها در مطالعات زیست‌سازگاری است. این آزمون به دلیل قابلیت تشخیص تغییرات ظریف در عملکرد سلولی، عدم تخریب سلول‌ها و امکان پایش طولانی‌مدت، جایگاه مهمی در ارزیابی ایمنی مواد و تجهیزات پزشکی دارد. نتایج حاصل از این آزمون اطلاعات ارزشمندی در خصوص اثرات مواد بر سلامت سلول‌ها فراهم نموده و در کنار سایر آزمون‌های سمیت سلولی، مبنای علمی مناسبی برای ارزیابی ایمنی زیستی و تصمیم‌گیری‌های رگولاتوری فراهم می‌سازد.

واژگان کلیدی: سمیت سلولی، Alamar Blue، زنده‌مانی سلولی، فعالیت متابولیکی سلول، زیست‌سازگاری، ISO 10993-5، کشت سلولی، ارزیابی ایمنی زیستی، مهار رشد سلولی، آزمون درون‌کشتگاهی، مواد پزشکی، تجهیزات پزشکی

آزمون های مشابه

تصویر خلاصه آزمون

⚠️ الزامات قانونی

انجام آزمون Alamar Blue برای اخذ پروانه ساخت، کد IRC و تاییدیه سازمان غذا و دارو جهت ورود به بازار ایران و بازارهای بین‌المللی الزامی است. این آزمون به عنوان یک روش کمی، فلوریمتری و غیرسمی برای ارزیابی سمیت سلولی در استاندارد ISO 10993-5 معرفی شده و نتایج آن برای اثبات عدم وجود سمیت سلولی تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی بهداشتی و دارویی مورد پذیرش مراجع قانونی قرار می‌گیرد.

تست سمیت سلولی Alamar Blue

هدف

در تست سمیت سلولی Alamar Blue، از یک ماده آبی رنگ و غیر نورتاب به نام Alamar Blue استفاده می‌شود. سلول‌های زنده این ماده را به محصولی قرمز رنگ و نورتاب تبدیل می‌کنند. شدت نورتابی یا رنگ قرمز تولید شده با تعداد سلول‌های زنده رابطه مستقیم دارد. این روش غیرسمی بوده و امکان پایش مداوم همان سلول‌ها را در چندین زمان مختلف فراهم می‌کند. برای مواد آرایشی بهداشتی، نانوذرات و عصاره‌های تجهیزات پزشکی بسیار مناسب است.

منابع رسمی

ISO 10993-5: این استاندارد مرجع اصلی برای انجام آزمون Alamar Blue می‌باشد. روش‌های فلوریمتری و رنگ سنجی مانند Alamar Blue به عنوان روش‌های کمی و معتبر برای ارزیابی سمیت سلولی معرفی شده است.

ISO 10993-12: این استاندارد به آماده‌سازی نمونه اختصاص دارد. نحوه آماده‌سازی نمونه‌های مختلف و همچنین شرایط عصاره‌گیری برای انجام آزمون‌های سمیت سلولی از جمله Alamar Blue، مطابق با این استاندارد انجام می‌شود.

OECD: روش Alamar Blue در مستندات OECD برای ارزیابی سمیت سلولی و به عنوان جایگزینی برای آزمون تحریک چشمی مورد استفاده قرار گرفته است.

USP: روش‌های مبتنی بر Alamar Blue به عنوان روش‌های معتبر برای ارزیابی زنده مانی سلولی و سمیت سلولی در USP پذیرفته شده‌اند.

دامنه کاربرد

مواردی که تست سمیت آلامار بلو الزامی است:

تمامی تجهیزات پزشکی که نیاز به ارزیابی سمیت سلولی دارند
مواد جاذب آب مانند هیدروژل‌ها و پانسمان‌ها
عصاره‌های حاصل از تجهیزات پزشکی
مواد دندانپزشکی مانند سمان‌ها و کامپوزیت‌ها
محصولات آرایشی بهداشتی مانند کرم‌ها، لوسیون‌ها و شامپوها
مواد دارویی و بیولوژیک

مواردی که تست سمیت آلامار بلو الزامی نیست:

موادی که دارای نورتابی ذاتی هستند
موادی که با معرف Alamar Blue واکنش شیمیایی می‌دهند

تعاریف

Alamar Blue: یک ماده آبی رنگ و غیر نورتاب است. ماده فعال آن Resazurin می‌باشد.

Resorufin: محصول قرمز رنگ و نورتاب حاصل از احیای Resazurin توسط سلول‌های زنده. شدت نورتابی تولید شده با تعداد سلول‌های زنده رابطه مستقیم دارد.

زنده مانی: درصد سلول‌های زنده در نمونه نسبت به نمونه کنترل که از طریق اندازه‌گیری شدت نورتابی تعیین می‌شود.

چکیده اطلاعات

استاندارد مرجع: ISO 10993-5
نوع روش: کمی – فلوریمتری / رنگ سنجی
شرایط انکوباسیون سلول‌ها با عصاره: دمای ۳۷ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد همراه با رطوبت و ۵ درصد دی اکسید کربن به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت
شرایط واکنش با Alamar Blue: دمای ۳۷ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱ تا ۴ ساعت
زمان و نحوه گواهی و گزارش‌دهی: ۱۰ تا ۱۵ روز کاری – گزارش کامل نتایج به زبان انگلیسی
دامنه تشخیص: اندازه‌گیری زنده مانی سلول‌ها برای انواع سلول‌های پستانداران

اصول کلی

اصل ردوکس: Alamar Blue یک شاخص ردوکس است که با نظارت بر محیط سلول زنده عمل می‌کند. ماده فعال آن Resazurin است که آبی رنگ و غیر نورتاب می‌باشد.

اصل احیا توسط سلول زنده: سلول‌های زنده قادرند Resazurin را به Resorufin (قرمز، نورتاب) تبدیل کنند.

اصل تناسب سیگنال با تعداد سلول زنده: شدت نورتابی یا رنگ تولید شده مستقیماً با تعداد سلول‌های زنده رابطه مستقیم دارد.

مزیت غیرسمی بودن: بر خلاف روش MTT، Alamar Blue برای سلول‌ها غیرسمی است و امکان پایش مداوم همان سلول‌ها را فراهم می‌کند.

تجهیزات و مواد مصرفی

تجهیزات اصلی: هود لامینار، انکوباتور ۳۷ تا ۳۸ درجه با ۵ درصد دی اکسید کربن، میکروسکوپ وارونه، دستگاه فلورومتر، فریزر ۸۰- درجه، سانتریفیوژ، پیپت اتوماتیک چند کاناله، دستگاه شمارش سلول

مواد مصرفی: رده سلولی L-929 مطابق ISO 10993-5، محیط کشت دارای ۱۰ درصد سرم، پلیت ۹۶ خانه‌ای، محلول Alamar Blue حاوی Resazurin، کنترل منفی، کنترل مثبت

آماده‌سازی نمونه

نمونه مطابق با ISO 10993-12 آماده می‌شود. برای روش الوشن، عصاره‌گیری در دمای ۳۷ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۴ تا ۷۲ ساعت انجام می‌شود. سپس رقت‌های مختلفی از عصاره تهیه می‌شود.

روش کار

کشت سلولی: سلول‌های L-929 در پلیت ۹۶ خانه‌ای کشت داده می‌شوند و به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور نگهداری می‌شوند.

اضافه کردن عصاره: محیط کشت قدیمی خارج شده و عصاره با رقت‌های مختلف به خانه‌ها اضافه می‌شود. هر رقت در ۴ تا ۶ تکرار تست می‌شود.

انکوباسیون اولیه: پلیت‌ها به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۷ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد و ۵ درصد دی اکسید کربن قرار می‌گیرند.

اضافه کردن Alamar Blue: محلول Alamar Blue به هر خانه اضافه می‌شود.

انکوباسیون نهایی: پلیت‌ها به مدت ۱ تا ۴ ساعت در انکوباتور قرار می‌گیرند.

اندازه‌گیری فلورسانس: شدت فلورسانس توسط دستگاه فلورومتر اندازه‌گیری می‌شود.

معیار پذیرش

درصد زنده مانی = (فلورسانس نمونه ÷ فلورسانس کنترل منفی) × 100

درجه	وضعیت	درصد زنده مانی
0	عاری از سمیت	بیشتر یا مساوی 80%
1	سمیت خفیف	70% تا 79%
2	سمیت متوسط	50% تا 69%
3	سمیت نسبتاً شدید	30% تا 49%
4	سمیت شدید	کمتر از 30%

نکته مهم: کاهش زنده مانی به کمتر از 70% نسبت به کنترل منفی، سمیت سلولی محسوب می‌شود (درجه 2 یا بالاتر).

جایگاه در فرآیند ارزیابی ایمنی

غربالگری غیرسمی و مداوم:

این آزمون به دلیل غیرسمی بودن نسبت به سلول‌ها، امکان پایش مداوم همان سلول‌ها را در چندین زمان مختلف فراهم می‌کند.

پیش‌بینی رفتار بیولوژیکی در بدن:

این آزمون به دلیل همبستگی عالی با نتایج حیوانی، یکی از قابل اعتمادترین روش‌های برون تنی است.

الزامات قانونی سازمان غذا و دارو:

سازمان غذا و داروی ایران و مراجع بین‌المللی انجام این آزمون را برای تجهیزات پزشکی پذیرفته‌اند. روش Alamar Blue به عنوان یک روش تایید شده برای ارزیابی زنده مانی سلولی و سمیت سلولی شناخته می‌شود.

تفاوت با سایر آزمون‌ها

تفاوت با روش XTT و MTT: روش Alamar Blue غیرسمی است و امکان پایش مداوم سلول‌ها را فراهم می‌کند، در حالی که روش‌های XTT و MTT برای سلول‌ها سمی هستند.

تفاوت با روش ATP: روش Alamar Blue نیازی به لیز سلولی ندارد و غیرسمی است، در حالی که روش ATP نیاز به لیز سلول‌ها دارد.

تفاوت با روش آگار دیفیوژن: روش Alamar Blue یک روش کمی و فلوریمتری است، در حالی که آگار دیفیوژن کیفی است.

مزیت اصلی روش Alamar Blue: این روش غیرسمی، ساده، سریع و دارای حساسیت بالا است. عدم نیاز به لیز سلولی و امکان پایش مداوم از مهمترین مزایای آن می‌باشد.

محتوای گزارش آزمون

مشخصات دقیق نمونه شامل توضیحات فنی، شماره لات و تاریخ تولید
رده سلولی استفاده شده L-929
شرایط عصاره‌گیری شامل دما، زمان و نوع محیط عصاره‌گیری
تاریخ شروع و پایان آزمون
شرح روش مطابق با ISO 10993-5 (روش Alamar Blue)
زمان انکوباسیون با Alamar Blue
جدول درصد زنده مانی برای هر رقت
درجه نهایی سمیت
مهر تایید و امضای مدیر فنی

سوالات متداول فنی و حقوقی

آیا آزمون Alamar Blue در ISO 10993-5 وجود دارد؟

بله، استاندارد ISO 10993-5 روش‌های فلوریمتری مانند Alamar Blue را به عنوان روش‌های کمی معتبر معرفی کرده است.

آیا تست سمیت آلامار بلو برای سلول‌های مختلف قابل استفاده است؟

بله، Alamar Blue برای انواع سلول‌ها از جمله فیبروبلاست‌ها، سلول‌های سرطانی، لنفوسیت‌ها و باکتری‌ها معتبر است.

چرا Alamar Blue غیرسمی محسوب می‌شود؟

بر خلاف روش‌هایی مانند MTT که محصول نهایی آنها برای سلول‌ها سمی است، Alamar Blue برای سلول‌ها سمیت ندارد.

آیا فنل رد موجود در محیط کشت با آلامار بلو تداخل ایجاد می‌کند؟

خیر، فنل رد موجود در محیط کشت تداخلی در آزمون Alamar Blue ایجاد نمی‌کند.

حداقل زمان انکوباسیون با Alamar Blue چقدر است؟

زمان استاندارد ۱ تا ۴ ساعت است.

آیا می‌توان از تست سمیت آلامار بلو به صورت رنگ سنجی استفاده کرد؟

بله، Alamar Blue هم به صورت فلوریمتری (حساسیت بالاتر) و هم به صورت رنگ سنجی (ساده‌تر) قابل اندازه‌گیری است.

آیا می‌توان از رده سلولی غیر از L-929 در تست سمیت آلامار بلو استفاده کرد؟

بله، اما برای پذیرش توسط سازمان غذا و دارو، استفاده از L-929 توصیه می‌شود.

زمان انجام تست سمیت آلامار بلو چقدر است؟

۱۰ تا ۱۵ روز کاری از تاریخ دریافت نمونه تا صدور گزارش نهایی.

آیا نتایج آزمون Alamar Blue برای تاییدیه FDA معتبر است؟

بله، سازمان غذا و داروی ایران، FDA و سازمان بهداشت جهانی نتایج این آزمون را برای اخذ تاییدیه می‌پذیرند.

تماس با واحد پشتیبانی

برای مشاوره رایگان و هماهنگی ارسال نمونه، با کارشناسان ما تماس بگیرید.

📱 پیام‌رسان بله: 989900100182+

📞 تماس تلفنی: 982191010809+

✉️ پیامک: 989900100182+

📋 مدارک

⚠️ تکمیل و ارسال کلیه مدارک و فرم‌های مورد نیاز پیش از ارسال نمونه به آزمایشگاه الزامی است. لطفاً مدارک را به‌صورت کامل و صحیح ارسال نمایید. در صورت وجود نقص یا مغایرت در اطلاعات، فرآیند پذیرش نمونه، بررسی فنی و شروع آزمون با تأخیر مواجه خواهد شد.

مدارک مورد نیاز قبل از ارسال نمونه به آزمایشگاه

🚚 ارسال نمونه

⚠️ پیش از ارسال نمونه، لطفاً الزامات و شرایط حمل، نگهداری و بسته‌بندی نمونه را به دقت مطالعه نموده و جهت اطمینان از پذیرش صحیح نمونه، با واحد پذیرش آزمایشگاه هماهنگی لازم را انجام دهید.

شرایط ارسال نمونه به آزمایشگاه

💰 هزینه آزمون

⚠️ جهت دریافت هزینه دقیق و به‌روز آزمون‌ها، لطفاً فرم درخواست آزمون را از طریق پیام‌رسان بله یا ایمیل برای آزمایشگاه ارسال نمایید. درخواست شما توسط کارشناسان فنی بررسی شده و هزینه نهایی بر اساس نوع آزمون، تعداد نمونه‌ها و الزامات مطالعه اعلام خواهد شد.

استعلام هزینه آزمون

📊 گزارش آزمون

⚠️ گزارش نهایی آزمون پس از تکمیل تمامی مراحل آزمایش، بررسی نتایج و تأیید واحد کنترل کیفیت، در کوتاه‌ترین زمان ممکن صادر شده و حداکثر ظرف 10 روز کاری در قالب گزارش رسمی انگلیسی به متقاضی تحویل خواهد شد.

گزارش نهایی آزمون

سمیت سلولی – آلامار بلو