آزمون های سمیت سلولی
الزام دریافت تأییدیه برای تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی و دارویی
خلاصه آزمون ها
زمینه و هدف: آزمون‌های سمیت سلولی (Cytotoxicity Tests) از بنیادی‌ترین و پرکاربردترین آزمون‌های ارزیابی زیست‌سازگاری مواد و تجهیزات پزشکی محسوب می‌شوند و نخستین مرحله غربالگری ایمنی بیولوژیکی بسیاری از محصولات پزشکی، دندانپزشکی و آزمایشگاهی را تشکیل می‌دهند. این آزمون‌ها بر اساس استانداردهای ISO 10993-5: Biological Evaluation of Medical Devices – Part 5: Tests for In Vitro Cytotoxicity و ISO 7405: Dentistry – Evaluation of Biocompatibility of Medical Devices Used in Dentistry انجام می‌شوند. هدف اصلی این مطالعات، بررسی اثرات سمی مستقیم یا غیرمستقیم مواد بر سلول‌های زنده و تعیین توانایی محصول در حفظ بقا، رشد و عملکرد طبیعی سلول‌ها است. مواد آزادشده از تجهیزات پزشکی ممکن است موجب آسیب غشای سلولی، اختلال متابولیسم، مهار تکثیر یا مرگ سلولی شوند؛ بنابراین ارزیابی سمیت سلولی نقش مهمی در شناسایی خطرات احتمالی پیش از انجام مطالعات حیوانی و بالینی دارد. در حوزه دندانپزشکی نیز این آزمون‌ها برای بررسی ایمنی موادی مانند کامپوزیت‌ها، سمان‌ها، آمالگام‌ها، مواد اندودنتیک و ایمپلنت‌های دندانی اهمیت ویژه‌ای دارند.
روش انجام: مطابق ISO 10993-5 و ISO 7405، آزمون‌های سمیت سلولی به صورت in vitro و با استفاده از رده‌های سلولی استاندارد انجام می‌شوند. سلول‌های مورد استفاده می‌توانند شامل فیبروبلاست‌های موش (L929)، فیبروبلاست‌های انسانی، سلول‌های اپیتلیالی یا سایر سلول‌های مرتبط با کاربرد محصول باشند.
سه روش اصلی برای ارزیابی سمیت سلولی عبارت‌اند از:
- روش تماس مستقیم (Direct Contact Method)
- روش تماس غیرمستقیم یا آگار دیفیوژن (Agar Diffusion Method)
- روش عصاره‌گیری یا استخراج (Extract Elution Method)
در تست سمیت سلولی، نمونه یا عصاره استخراج‌شده از محصول با سلول‌های کشت‌شده در شرایط کنترل‌شده تماس داده می‌شود. پس از دوره مواجهه که معمولاً بین 24 تا 72 ساعت است، زنده‌مانی سلول‌ها و میزان آسیب سلولی با استفاده از روش‌های مختلف اندازه‌گیری می‌شود.
از متداول‌ترین روش‌های سنجش می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
- آزمون MTT
- آزمون XTT
- آزمون Alamar Blue
- آزمون Neutral Red Uptake
- آزمون LDH Release
- آزمون CFDA-AM
- شمارش سلولی و بررسی مورفولوژی سلول‌ها
علاوه بر ارزیابی کمی، تغییرات مورفولوژیک شامل گردشدگی سلول‌ها، جداشدگی از سطح، تخریب غشای سلولی و کاهش تراکم سلولی نیز توسط میکروسکوپ بررسی می‌شوند.
یافته‌ها و طبقه‌بندی:
نتایج آزمون سمیت سلولی معمولاً بر اساس درصد زنده‌مانی سلول‌ها نسبت به گروه کنترل تفسیر می‌شوند. طبق ISO 10993-5، اگر زنده‌مانی سلولی به کمتر از 70 درصد کنترل منفی کاهش یابد، نمونه دارای اثر سمیت سلولی تلقی می‌شود.
بر اساس شدت پاسخ سلولی، نتایج معمولاً در دسته‌های زیر طبقه‌بندی می‌شوند:
- غیرسمی (Non-Cytotoxic)
- سمیت خفیف
- سمیت متوسط
- سمیت شدید
همچنین در برخی روش‌ها سیستم نمره‌دهی مورفولوژیک از 0 تا 4 برای ارزیابی میزان تخریب سلولی استفاده می‌شود. مواد زیست‌سازگار معمولاً موجب حفظ مورفولوژی طبیعی، رشد مناسب و بقای سلولی بالا می‌شوند، در حالی که مواد سمی باعث کاهش شدید تعداد سلول‌های زنده، تغییر شکل سلولی و مرگ سلولی خواهند شد.
نتیجه‌گیری: تست سمیت سلولی بر اساس ISO 10993-5 و ISO 7405 از مهم‌ترین ابزارهای غربالگری ایمنی زیستی تجهیزات پزشکی و مواد دندانپزشکی هستند. این آزمون‌ها امکان ارزیابی سریع، حساس و اقتصادی اثرات مواد بر سلول‌های زنده را فراهم کرده و نقش مهمی در کاهش ریسک زیستی محصولات ایفا می‌کنند. نتایج این مطالعات مبنای تصمیم‌گیری برای ادامه ارزیابی‌های زیست‌سازگاری، انجام مطالعات حیوانی و اخذ مجوزهای قانونی هستند. اجرای صحیح آزمون‌های سمیت سلولی موجب افزایش اطمینان از ایمنی محصولات و حفاظت از سلامت مصرف‌کنندگان می‌شود.
واژگان کلیدی: ISO 10993-5، ISO 7405، سمیت سلولی، Cytotoxicity، Biocompatibility، زیست‌سازگاری، MTT Assay، XTT Assay، Alamar Blue، LDH Assay، CFDA-AM، Neutral Red Uptake، کشت سلولی، زنده‌مانی سلولی، ارزیابی ایمنی تجهیزات پزشکی، مواد دندانپزشکی.
تصویر خلاصه آزمون ها
⚠️ الزامات قانونی
روش‌های کمی – مطابق ISO 10993-5
آزمون MTT (روش ارجح)
روش MTT یک روش کمی برای ارزیابی سمیت سلولی است که در آن نمک تترازولیوم زرد رنگ توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز موجود در میتوکندری سلول‌های زنده به کریستال‌های بنفش رنگ فرمازان تبدیل می‌شود. پس از حل کردن کریستال‌ها، جذب نوری در طول موج ۵۷۰ نانومتر اندازه‌گیری شده و میزان آن با تعداد سلول‌های زنده رابطه مستقیم دارد. معیار پذیرش: زنده مانی نسبی ≥ ۷۰ درصد نشانه غیرسمی و زنده مانی نسبی < ۷۰ درصد نشانه سمی بودن نمونه است.
آزمون XTT
آزمون XTT مشابه روش MTT است، اما محصول فرمازان تولید شده محلول در آب بوده و نیاز به مرحله حل کردن کریستال‌ها را حذف می‌کند. این امر امکان انجام مراحل بیشتر روی همان نمونه را فراهم می‌کند. این روش برای غربالگری با توان بالا مناسب‌تر است.
آزمون NRU
آزمون قرمز خنثی بر اساس جذب رنگ قرمز خنثی در لیزوزوم‌های سلول‌های زنده و دست نخورده است. سلول‌های زنده رنگ را جذب و در لیزوزوم‌ها ذخیره می‌کنند، در حالی که سلول‌های مرده یا آسیب دیده این توانایی را ندارند. پس از انکوباسیون، رنگ استخراج شده و جذب نوری اندازه‌گیری می‌شود. این روش به طور خاص یکپارچگی غشای لیزوزومی را ارزیابی می‌کند.
آزمون رزازورین
رزازورین (Alamar Blue) یک شاخص اکسیداسیون-احیا است که توسط آنزیم‌های میتوکندری و سیتوزولی سلول‌های زنده از حالت آبی غیرفلورسنت به حالت صورتی فلورسنت (رسوروفین) تبدیل می‌شود. شدت فلورسانس اندازه‌گیری شده با تعداد سلول‌های زنده رابطه مستقیم دارد. مزیت این روش غیرسمی بودن برای سلول‌ها است که امکان ادامه آزمایش روی همان نمونه را فراهم می‌کند.
آزمون LDH
آزمون LDH بر خلاف روش‌های قبلی که فعالیت سلول‌های زنده را اندازه می‌گیرند، مستقیماً مرگ سلولی را از طریق اندازه‌گیری آنزیم لاکتات دهیدروژناز آزاد شده از سلول‌های دارای غشای آسیب دیده (نکروز) ارزیابی می‌کند. آنزیم LDH در سیتوپلاسم تمام سلول‌ها وجود دارد و با آسیب غشا به سرعت به محیط کشت آزاد می‌شود. این روش به ویژه برای تمایز بین نکروز و آپوپتوز مفید است.
آزمون CFDA-AM
این روش فلورسانس برای ارزیابی زنده مانی سلول‌ها بر اساس فعالیت استراز در غشای سالم است. CFDA-AM وارد سلول می‌شود و توسط استرازهای داخل سلولی هیدرولیز می‌گردد و محصول فلورسنت تولید می‌کند. میزان فلورسانس با یکپارچگی غشا و تعداد سلول‌های زنده رابطه مستقیم دارد.
روش‌های کیفی – مطابق ISO 10993-5
آزمون تماس مستقیم (Direct Contact)
نمونه به طور مستقیم روی لایه سلولی قرار داده می‌شود. در طول انکوباسیون، مواد قابل نفوذ از نمونه به محیط کشت منتشر شده و با سلول‌ها تماس پیدا می‌کنند. واکنش سمیت با مشاهده ناحیه لیز سلولی و تغییرات مورفولوژی در اطراف نمونه ارزیابی می‌شود. این روش برای مواد با چگالی کم مانند لنزهای تماسی یا مایعات شفاف توصیه می‌شود.
آزمون عصاره (MEM Elution)
در این روش، عصاره حاصل از نمونه (طبق ISO 10993-12) به روی یک لایه سلولی (معمولاً ال-۹۲۹) اضافه می‌شود. پس از انکوباسیون، سلول‌ها زیر میکروسکوپ از نظر تغییرات مورفولوژی، دژنراسیون و لیز سلولی بررسی می‌شوند. نتایج به صورت درجه سمیت ۰ تا ۴ (غیرسمی تا سمیت شدید) گزارش می‌گردد. این روش برای اکثر تجهیزات پزشکی مناسب است.
آزمون توزیع آگار (Agar Overlay)
یک لایه نازک آگار حاوی مواد مغذی روی لایه سلولی قرار داده می‌شود و نمونه روی لایه آگار گذاشته می‌شود. آگار به عنوان یک فیلتر عمل کرده و تنها مواد قابل نفوذ را به سمت سلول‌ها عبور می‌دهد. پس از انکوباسیون، ناحیه سلول‌های دژنره یا لیز شده در زیر و اطراف نمونه بررسی می‌شود. این روش برای مواد با چگالی بالا مانند پمادها و ژل‌های نیمه جامد مناسب است.
روش‌های کیفی – مطابق ISO 7405
آزمون انتشار آگار (Agar Diffusion)
این روش برای ارزیابی سمیت غیراختصاصی مواد دندانی پس از انتشار از طریق آگار طراحی شده است. بر روی کشت سلولی (اپیتلیال یا فیبروبلاست)، یک لایه آگار حاوی محیط کشت و رنگ قرمز خنثی قرار داده می‌شود. نمونه روی آگار گذاشته شده و به مدت ۲۴ ساعت انکوبه می‌گردد. ارزیابی بر اساس دو شاخص انجام می‌شود: شاخص تغییر رنگ و شاخص لیز سلولی، هر دو در مقیاس ۰ تا ۴. این روش برای مواد دندانی اختصاصی می‌باشد.
آزمون سد دنتین (Dentine Barrier)
این آزمون به طور خاص برای شبیه‌سازی شرایط واقعی حفره دندان طراحی شده است. یک برش نازک از دنتین (انسان یا گاو) با ضخامت ۵۰۰ ± ۵۰ میکرومتر به عنوان سد بین ماده دندانی و پالپ دندان عمل می‌کند. در یک سمت دنتین، ماده مورد آزمایش قرار می‌گیرد و در سمت دیگر (محفظه پالپ)، سلول‌هایی مشابه سلول‌های پالپ دندان کشت می‌شوند. پس از انکوباسیون، زنده مانی سلول‌ها با روش MTT تعیین می‌شود. این آزمون برای مواد ترمیمی، چسب‌های دندانی و سمان‌ها ضروری است.
آزمون انتشار فیلتر (Filter Diffusion)
در این روش، سلول‌ها روی یک فیلتر استات سلولز کشت داده می‌شوند. نمونه روی فیلتر قرار گرفته و مواد سمی از طریق فیلتر منتشر می‌شوند. پس از انکوباسیون در زمان‌های ۲ و ۲۴ ساعت، فیلتر برداشته شده و کاهش فعالیت آنزیم سوکسینات دهیدروژناز (روش A) یا هیدرولاز غیراختصاصی (روش B) با رنگ‌آمیزی ارزیابی می‌گردد. ناحیه تغییر رنگ روی فیلتر، میزان آسیب سلولی را تعیین می‌کند.
آزمون ARE
این یک روش جدید در ویرایش ۲۰۲۵ استاندارد ISO 7405 است که استرس اکسیداتیو ناشی از مواد دندانی (به ویژه رزین‌ها و چسب‌ها) را ارزیابی می‌کند. سلول‌های مهندسی شده حاوی عنصر پاسخگو به آنتی‌اکسیدان در معرض ماده مورد آزمایش قرار می‌گیرند. فعال شدن مسیر ARE توسط ماده، نشان دهنده ایجاد استرس اکسیداتیو در سلول است. این روش امکان شناسایی زودهنگام ریسک‌های سمیت را فراهم می‌کند.
کدام آزمون را برای محصول خود انتخاب کنیم؟
انتخاب آزمون مناسب برای ارزیابی سمیت سلولی محصول پزشکی یا دندانی بر اساس استانداردهای ISO 10993-5 و ISO 7405 به عواملی مانند ماهیت فیزیکی نمونه (جامد، مایع، ژل)، تخلخل، هندسه و محل مصرف بستگی دارد.
3 رویکرد اصلی در استاندارد ISO 10993-5 برای انجام آزمون سمیت سلولی وجود دارد:
آزمون عصاره‌گیری: حساسترین روش رایج است. نمونه در یک مایع (محیط کشت) تیمار می‌شود و سپس عصاره حاصل روی رده سلولی قرار می‌گیرد. این روش برای طیف گسترده‌ای از محصولات نهایی، به‌ویژه محصولات بدون تخلخل با سطح تماس کم (مانند کاتترها) مناسب است.
آزمون تماس مستقیم: نمونه مستقیماً روی لایه سلولی قرار می‌گیرد. برای مواد انعطاف‌پذیر یا ورقه‌ای مانند پانسمان‌ها، فیلم‌ها و پلیمرهای نرم ایده‌آل است.
آزمون تماس غیرمستقیم: شامل آگار دیفیوژن و فیلتر دیفیوژن. یک لایه آگار سلول‌ها را از نمونه جدا می‌کند و مواد سمی باید از آن عبور کنند. این روش برای مواد متراکم یا موادی که عصاره‌گیری از آنها دشوار است مناسب می‌باشد.
با این حال، استاندارد ISO 7405 که ویژه محصولات دندانپزشکی تدوین شده است، آزمون‌های خاص‌تری را تعریف می‌کند:
برای ارزیابی سمیت عمومی، آزمون‌های آگار دیفیوژن و فیلتر دیفیوژن قابل استفاده هستند، اما با الزامات ارزیابی خاص‌تر برای دندانپزشکی.
برای دستگاه‌هایی که با پالپ دندان در ارتباط هستند (مانند مواد ترمیمی)، آزمون سمیت سلولی سد عاجی اجباری است. این آزمون یک حفره دندانی را شبیه‌سازی کرده و نفوذ مواد از طریق عاج به سمت پالپ را بررسی می‌کند.
نتیجه‌گیری: توصیه می‌شود ابتدا بر اساس بافت هدف و ماهیت فیزیکی محصول، نوع تماس (مستقیم یا غیرمستقیم) مشخص شود. برای محصولات دندانپزشکی که با بافت‌های عمقی (مانند عاج و پالپ) تماس دارند، استاندارد ISO 7405 و روش سد عاجی مرتبط‌ترین گزینه است. برای سایر تجهیزات پزشکی عمومی، آزمون عصاره‌گیری طبق ISO 10993-5 به دلیل حساسیت بالا در تشخیص مواد شوینده شیمیایی و عدم ایجاد آسیب فیزیکی به سلول‌ها، به عنوان استاندارد طلایی توصیه می‌شود.
تکمیل و ارسال کلیه مدارک و فرم‌های مورد نیاز پیش از ارسال نمونه به آزمایشگاه الزامی است. لطفاً مدارک را به‌صورت کامل و صحیح ارسال نمایید. در صورت وجود نقص یا مغایرت در اطلاعات، فرآیند پذیرش نمونه، بررسی فنی و شروع آزمون با تأخیر مواجه خواهد شد.
پیش از ارسال نمونه، لطفاً الزامات و شرایط حمل، نگهداری و بسته‌بندی نمونه را به دقت مطالعه نموده و جهت اطمینان از پذیرش صحیح نمونه، با واحد پذیرش آزمایشگاه هماهنگی لازم را انجام دهید.
جهت دریافت هزینه دقیق و به‌روز آزمون‌ها، لطفاً فرم درخواست آزمون را از طریق پیام‌رسان بله یا ایمیل برای آزمایشگاه ارسال نمایید. درخواست شما توسط کارشناسان فنی بررسی شده و هزینه نهایی بر اساس نوع آزمون، تعداد نمونه‌ها و الزامات مطالعه اعلام خواهد شد.
گزارش نهایی آزمون پس از تکمیل تمامی مراحل آزمایش، بررسی نتایج و تأیید واحد کنترل کیفیت، در کوتاه‌ترین زمان ممکن صادر شده و حداکثر ظرف 10 روز کاری در قالب گزارش رسمی انگلیسی به متقاضی تحویل خواهد شد.
