آزمون میکرونوکلئوس – برون تنی

 

الزام دریافت تأییدیه برای تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی و دارویی

خلاصه آزمون

زمینه و هدف: ارزیابی آسیب‌های ژنتیکی ناشی از مواد و تجهیزات مورد استفاده در حوزه سلامت یکی از بخش‌های اساسی مطالعات ایمنی زیستی محسوب می‌شود. بسیاری از مواد شیمیایی، فرآورده‌های پزشکی، دارویی و آرایشی بهداشتی می‌توانند موجب آسیب به کروموزوم‌ها یا اختلال در فرآیند تقسیم سلولی شوند. این تغییرات ممکن است منجر به ناپایداری ژنتیکی، جهش‌های سلولی، اختلالات تکاملی و افزایش خطر بروز بیماری‌های مزمن از جمله سرطان گردند. آزمون سمیت ژنی میکرونوکلئوس یکی از معتبرترین روش‌های ارزیابی ژنوتوکسیسیتی در سلول‌های پستانداران است که برای شناسایی آسیب‌های کروموزومی و اختلالات عددی کروموزوم‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این آزمون به دلیل حساسیت بالا و قابلیت شناسایی طیف گسترده‌ای از آسیب‌های ژنتیکی، جایگاه ویژه‌ای در مطالعات زیست‌سازگاری و ارزیابی ایمنی محصولات دارد.

روش انجام: در تست سمیت ژنی میکرونوکلئوس، سلول‌های پستانداران در شرایط کنترل‌شده کشت داده شده و سپس در معرض غلظت‌های مختلف ماده یا عصاره آزمون قرار می‌گیرند. ارزیابی معمولاً در حضور و عدم حضور سیستم فعال‌سازی متابولیکی انجام می‌شود تا امکان شناسایی ترکیباتی که پس از متابولیسم دارای اثر ژنوتوکسیک می‌شوند نیز فراهم گردد. پس از پایان دوره تماس، ماده‌ای که مانع تکمیل فرآیند تقسیم سلولی می‌شود به محیط کشت افزوده می‌شود تا سلول‌های دو هسته‌ای تشکیل شوند. در ادامه سلول‌ها تثبیت، رنگ‌آمیزی و زیر میکروسکوپ بررسی می‌شوند. در سلول‌هایی که طی تقسیم دچار شکست کروموزومی یا اختلال در جداسازی کروموزوم‌ها شده‌اند، قطعات DNA یا کروموزوم‌های کامل خارج از هسته اصلی باقی مانده و ساختارهای کوچکی به نام میکرونوکلئوس ایجاد می‌کنند. تعداد سلول‌های دارای میکرونوکلئوس در مقایسه با گروه کنترل شمارش و تحلیل می‌شود.

یافته‌ها و طبقه‌بندی: افزایش تعداد سلول‌های دارای میکرونوکلئوس نسبت به کنترل منفی نشان‌دهنده وجود آسیب ژنتیکی ناشی از ماده مورد بررسی است. این آزمون قادر به شناسایی دو گروه اصلی از آسیب‌های ژنتیکی شامل شکست کروموزوم‌ها و اختلال در توزیع صحیح کروموزوم‌ها در زمان تقسیم سلولی می‌باشد. نتایج بر اساس فراوانی میکرونوکلئوس، وجود رابطه وابسته به غلظت، میزان سمیت سلولی و انطباق با معیارهای پذیرش تفسیر می‌شوند. مشاهده افزایش معنی‌دار و تکرارپذیر تعداد سلول‌های دارای میکرونوکلئوس به عنوان پاسخ مثبت ژنوتوکسیک طبقه‌بندی می‌شود. در مقابل، عدم مشاهده افزایش معنی‌دار در شرایط معتبر آزمون نشان‌دهنده نبود شواهد آسیب ژنتیکی در محدوده غلظت‌های بررسی‌شده است.

نتیجه‌گیری: آزمون سمیت ژنی میکرونوکلئوس یکی از حساس‌ترین و پذیرفته‌شده‌ترین روش‌های ارزیابی آسیب‌های کروموزومی و اختلالات تقسیم سلولی در سلول‌های پستانداران است. این آزمون اطلاعات ارزشمندی در خصوص پتانسیل ژنوتوکسیک مواد فراهم نموده و نقش مهمی در ارزیابی ایمنی تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات دارویی و فرآورده‌های آرایشی و بهداشتی ایفا می‌کند. نتایج حاصل از این آزمون در کنار سایر مطالعات ژنوتوکسیسیتی، مبنای علمی مناسبی برای ارزیابی ریسک ژنتیکی و تصمیم‌گیری‌های رگولاتوری در زمینه ایمنی محصولات فراهم می‌سازد.

واژگان کلیدی: سمیت ژنی، ژنوتوکسیسیتی، میکرونوکلئوس، ریز‌هسته، آسیب کروموزومی، اختلال تقسیم سلولی، سلول‌های پستانداران، زیست‌سازگاری، ISO 10993-3، ایمنی زیستی، جهش‌زایی، ارزیابی ریسک ژنتیکی

آزمون های مشابه

تصویر خلاصه آزمون

خلاصه تست سمیت ژنی میکرونوکلئوس

⚠️ الزامات قانونی

انجام آزمون ریزهسته برون تنی برای اخذ پروانه ساخت، کد IRC و تاییدیه سازمان غذا و دارو جهت ورود به بازار ایران و بازارهای بین‌المللی، برای تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت (بیشتر از 24 ساعت) و تماس ایمپلنت (بیشتر از 30 روز) الزامی است. این آزمون به عنوان یکی از سه روش اصلی معتبر برون تنی برای ارزیابی سمیت ژنی در کنار آزمون ایمز معرفی شده است و قادر به تشخیص همزمان clastogenicity که همان شکست کروموزومی است و aneugenicity که ناهنجاری دوک میتوزی می‌باشد.

تست میکرونوکلئوس

آزمون ریزهسته یکی از سه روش اصلی معتبر برای ارزیابی سمیت ژنی بر اساس استاندارد OECD 487 و ISO 10993-3 است که مشخص می‌کند محصول شما آیا باعث آسیب کروموزومی می‌شود یا خیر. این آزمون قادر است هم شکست کروموزومی و هم ناهنجاری در تقسیم سلولی را به طور همزمان تشخیص دهد و به عنوان جایگزین ساده‌تر و سریع‌تر برای آزمون انحراف کروموزومی توصیه می‌شود. انجام این آزمون برای تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت (بیشتر از 24 ساعت) و تماس ایمپلنت (بیشتر از 30 روز) الزامی است. آزمایشگاه سنجش ساناژن این آزمون را با رعایت اصول GLP و تحت استاندارد ISO 17025 انجام می دهد.

OECD 487: دستورالعمل مرجع اصلی برای انجام آزمون ریزهسته برون تنی. این آزمون برای شناسایی عواملی طراحی شده است که باعث ایجاد ریزهسته در سیتوپلاسم سلول‌ها می‌شوند.

ISO 10993-3: استاندارد اصلی برای انجام آزمون‌های سمیت ژنی تجهیزات پزشکی. بر اساس این استاندارد، OECD 487 به عنوان یک روش معتبر برون تنی در کنار OECD 471 و OECD 473 برای ارزیابی سمیت ژنی معرفی شده است.

ISO 10993-12: اختصاص به آماده‌سازی نمونه و عصاره‌گیری. نحوه برش، آماده‌سازی و عصاره‌گیری نمونه‌ها دقیقاً مطابق با این استاندارد انجام می‌شود.

OECD 473: دستورالعمل برای آزمون انحراف کروموزومی برون تنی که روش قدیمی‌تر اما همچنان معتبر است. OECD 487 به عنوان جایگزین ساده‌تر، سریع‌تر و قابل اتوماسیون‌تر توصیه می‌شود.

تست میکرونوکلئوس الزامی است برای:

  • تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت (بیشتر از 24 ساعت تا 30 روز)
  • تجهیزات پزشکی با تماس ایمپلنت (بیشتر از 30 روز)
  • تجهیزات پزشکی ساخته شده از پلیمر، فلز، سرامیک و کامپوزیت که احتمال آزادسازی ترکیبات با پتانسیل کلستوژنیک یا آنیوژنیک دارند مانند ایمپلنت‌های ارتوپدی، استنت‌های دارویی، دریچه‌های قلبی، پیس میکر، مواد دندانی و ارتودنسی
  • محصولات آرایشی بهداشتی و دارویی که نیاز به ارزیابی سمیت ژنی دارند
  • موادی که در آزمون ایمز نتیجه منفی دارند اما مشکوک به سمیت ژنی هستند، زیرا آزمون ریزهسته حساسیت بالاتری دارد

تست میکرونوکلئوس الزامی نیست برای:

  • تجهیزات پزشکی با تماس سطحی محدود (کمتر از 24 ساعت) مانند کاتترهای کوتاه مدت، سوزن‌ها و لوله‌های تغذیه
  • تجهیزات پزشکی که قبلاً ترکیبات آنها به عنوان غیر ژنوتوکسیک شناخته شده است

Micronucleus: یک هسته کوچک اضافی در سیتوپلاسم سلول‌ها که از قطعات کروموزومی ناشی از شکست کروموزومی یا از کل کروموزوم‌های عقب مانده در حین تقسیم سلولی منشاء می‌گیرد.

Clastogenicity: توانایی یک ماده در ایجاد شکست کروموزومی. در آزمون ریزهسته، micronucleusهای ناشی از شکست کروموزومی حاوی قطعات DNA بدون سانترومر هستند.

Aneugenicity: توانایی یک ماده در ایجاد تغییر در تعداد کروموزوم‌ها از طریق تداخل با دستگاه تقسیم سلولی. micronucleusهای ناشی از aneugenicity حاوی کل کروموزوم‌ها هستند.

 CBPI: شاخصی برای اندازه‌گیری سمیت سلولی و اثرات ضدتکثیری ماده بر سلول‌ها. این شاخص بر اساس نسبت سلول‌های تک هسته‌ای، دو هسته‌ای و چند هسته‌ای محاسبه می‌شود.

  • استاندارد مرجع: OECD 487 در کنار ISO 10993-3
  • نوع روش: کمی و میکروسکوپی با استفاده از شمارش ریزهسته
  • رده سلولی: سلول TK6 که سلول لنفوبلاستوئید انسانی است، همچنین لنفوسیت انسانی، سلول CHO، سلول V79 و سلول L5178Y
  • شرایط انکوباسیون سلول‌ها با ماده: دمای 37 تا 38 درجه سانتی‌گراد، رطوبت مناسب، دی اکسید کربن 5 درصد
  • تیمار کوتاه مدت: 3 تا 6 ساعت با و بدون فعال کننده متابولیک S9
  • تیمار طولانی مدت: 20 تا 24 ساعت بدون فعال کننده متابولیک S9
  • فعال کننده متابولیک: مخلوط S9
  • مدت زمان انجام و گزارش: 6 تا 8 هفته کاری
  • گزارش نهایی: فقط به زبان انگلیسی
  • دامنه تشخیص: ارزیابی همزمان clastogenicity یا شکست کروموزومی و aneugenicity یا ناهنجاری دوک میتوزی

تشکیل ریزهسته: در تقسیم سلولی، قطعات کروموزومی یا کروموزوم‌های جا مانده به صورت micronucleus در سیتوپلاسم ظاهر می‌شوند. فراوانی آن نشانگر سمیت ژنی است.

تمایز کلستوژن از آنیوژن: با روش FISH می‌توان micronucleus ناشی از شکست کروموزومی را از ناشی از اختلال دوک میتوزی جدا کرد.

مهار سیتوکینزیس: ماده سیتوکالاسین B تقسیم سیتوپلاسم را متوقف کرده و سلول‌های دو هسته‌ای قابل شناسایی می‌شوند. micronucleus فقط در این سلول‌ها شمارش می‌شود.

محاسبه فراوانی ریزهسته: حداقل 2000 سلول دو هسته‌ای بررسی شده و فراوانی micronucleus محاسبه می‌شود.

شاخص CBPI: کاهش این شاخص نشان دهنده سمیت سلولی یا اثرات ضدتکثیری ماده است.

تجهیزات اصلی: هود لامینار، انکوباتور دی اکسید کربن، میکروسکوپ فلورسانس، شمارشگر خودکار ریزهسته، سانتریفیوژ، فریزر 80- درجه، حمام آب، پیپت اتوماتیک، هموسایتومتر، لام و لامل، سیتواسپین

مواد مصرفی اصلی: رده سلولی TK6 یا لنفوسیت انسانی یا CHO، محیط کشت با 10 تا 15 درصد سرم، سیتوکالاسین B، مخلوط S9، رنگ DAPI، پروب FISH، کنترل منفی، کنترل مثبت clastogen، کنترل مثبت aneugen، بافر، فیکساتیو

نمونه مطابق استاندارد ISO 10993-12 آماده می‌شود. عصاره‌گیری در حلال قطبی و حلال غیرقطبی انجام می‌گردد. نسبت سطح به حجم رعایت شده و عصاره‌گیری در دمای 37 تا 38 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 تا 72 ساعت انجام می‌شود. سپس حداقل 3 غلظت از عصاره تهیه می‌گردد.

کشت سلولی: سلول‌های TK6 یا لنفوسیت انسانی در فلاسک در محیط کشت مناسب در انکوباتور با دمای 37 تا 38 درجه سانتی‌گراد و دی اکسید کربن 5 درصد کشت داده می‌شوند. برای لنفوسیت‌های انسانی، تحریک با فیتوهماگلوتینین به مدت 48 تا 72 ساعت انجام می‌شود.

تیمار کوتاه مدت (3 تا 6 ساعت): سلول‌ها به مدت 3 تا 6 ساعت در حضور و عدم حضور S9 در معرض ماده آزمون قرار می‌گیرند. سپس ماده آزمون خارج شده، سلول‌ها شسته شده و در محیط کشت تازه بدون ماده به مدت دوره بهبودی انکوبه می‌شوند.

تیمار طولانی مدت (20 تا 24 ساعت): سلول‌ها به مدت 20 تا 24 ساعت بدون S9 در معرض ماده آزمون قرار می‌گیرند و دوره بهبودی ندارند.

افزودن سیتوکالاسین B: برای سلول‌های لنفوسیت، ماده سیتوکالاسین B به محیط کشت اضافه می‌شود تا سیتوکینزیس مسدود شود.

برداشت سلول‌ها و آماده‌سازی لام: سلول‌ها با سانتریفیوژ جمع‌آوری می‌شوند. به سلول‌ها محلول هیپوتونیک اضافه می‌شود و انکوبه می‌گردند. سپس سلول‌ها در فیکساتیو حداقل 3 بار فیکس می‌شوند و بر روی لام سرد و مرطوب ریخته شده و خشک می‌شوند.

رنگ‌آمیزی: لام‌ها در رنگ فلورسنت اختصاصی DNA مانند DAPI غوطه‌ور می‌شوند. برای تمایز بین clastogen و aneugen، روش FISH با پروب‌های پان‌سانترومری انجام می‌شود.

بررسی میکروسکوپی و شمارش ریزهسته: حداقل 2000 سلول دو هسته‌ای در هر غلظت، هر زمان نمونه‌برداری و هر شرایط با یا بدون S9 زیر میکروسکوپ فلورسانس بررسی می‌شوند. micronucleusها شناسایی و شمارش می‌شوند. همچنین CBPI برای ارزیابی سمیت سلولی محاسبه می‌گردد.

نتیجه آزمون بر اساس درصد سلول‌های دو هسته‌ای حاوی micronucleus در هر غلظت و مقایسه با کنترل منفی تعیین می‌شود. همچنین سمیت سلولی از طریق CBPI برای هر غلظت محاسبه می‌گردد:

نتیجه وضعیت معیار پذیرش 
غیر ژنوتوکسیک منفی (Negative) درصد سلول‌های حاوی micronucleus در محدوده کنترل منفی است
کلستوژنیک مثبت (Positive) افزایش وابسته به غلظت در درصد سلول‌های حاوی micronucleus همراه با micronucleusهای فاقد سانترومر (FISH منفی)
آنیوژنیک مثبت (Positive) افزایش وابسته به غلظت در درصد سلول‌های حاوی micronucleus همراه با micronucleusهای حاوی سانترومر (FISH مثبت)
  • نکته ۱: سمیت سلولی نباید بیش از 55 درصد کاهش نسبت به کنترل منفی داشته باشد، در غیر این صورت غلظت تست غیرقابل قبول است.
  • نکته ۲: مواد clastogenic معمولاً باعث افزایش micronucleus در هر دو نوع سلول TK6 و لنفوسیت می‌شوند. مواد aneugenic ممکن است اثرات خاص سلولی نشان دهند.
  • نکته ۳: روش FISH با پروب‌های پان‌سانترومری برای تمایز بین clastogen و aneugen توصیه شده است. این تمایز برای طبقه‌بندی مکانیسم سمیت ژنی و ارزیابی خطر ضروری است.
  • نکته ۴: مطابق استانداردهای OECD 487 و ISO 10993-3، نتایج مثبت در آزمون ریزهسته برون تنی معمولاً نیاز به تأیید با یک آزمون درون تنی مانند آزمون ریزهسته درون تنی دارند.

روش ارجح برای تشخیص آسیب کروموزومی:

این آزمون به عنوان یکی از سه روش اصلی معتبر برون تنی طبق استاندارد ISO 10993-3 در کنار آزمون ایمز عمل می‌کند و به عنوان جایگزین ارجح برای آزمون انحراف کروموزومی توصیه می‌شود. این آزمون قادر به تشخیص همزمان clastogenicity و aneugenicity است.

پیش‌بینی سرطان‌زایی و جهش‌زایی:

micronucleus نشانگر آسیب کروموزومی است که یکی از شاخص‌های قوی سرطان‌زایی بالقوه مواد می‌باشد. تمایز بین clastogen و aneugen در ارزیابی خطر مهم است، زیرا aneugenها ممکن است دارای آستانه ایمنی باشند.

الزامات قانونی سازمان غذا و دارو:

سازمان غذا و داروی ایران و سایر مراجع نظارتی بین‌المللی مانند FDA و MHRA، انجام آزمون ریزهسته برون تنی را برای تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت و ایمپلنت به عنوان بخش اجباری باتری سمیت ژنی الزامی می‌دانند. FDA این روش را به عنوان جایگزین قابل قبول برای آزمون انحراف کروموزومی پذیرفته است.

مقایسه با ایمز: ایمز جهش نقطه‌ای در باکتری را تشخیص می‌دهد، اما OECD 487 آسیب کروموزومی در سلول پستانداران را ارزیابی می‌کند.

مقایسه با انحراف کروموزومی: روش انحراف کروموزومی مستقیم و نیازمند متخصص ماهر است، اما OECD 487 غیرمستقیم، سریع‌تر، ساده‌تر و قابل اتوماسیون است و aneugenicity را نیز تشخیص می‌دهد.

مقایسه با HPRT: جهش ژنی را تشخیص می‌دهد، اما OECD 487 آسیب کروموزومی را تشخیص می‌دهد.

مقایسه با Comet: شکست DNA را در سطح رشته تشخیص می‌دهد، اما OECD 487 آسیب کروموزومی را پس از تقسیم سلولی تشخیص می‌دهد.

مزیت اصلی: ساده‌تر، سریع‌تر، ارزان‌تر و تشخیص همزمان clastogenicity و aneugenicity

  • مشخصات دقیق نمونه شامل توضیحات فنی، شماره لات و تاریخ تولید
  • شرایط عصاره‌گیری شامل نسبت سطح به حجم، حلال، دما و زمان مطابق با استاندارد ISO 10993-12
  • رده سلولی استفاده شده شامل نوع، منبع و پاساژ سلول
  • شرایط تیمار شامل زمان، با یا بدون S9 و غلظت‌ها
  • نتایج سمیت سلولی یا CBPI برای تعیین محدوده غلظت‌های غیرسمی
  • غلظت‌های تست شده عصاره شامل حداقل 3 غلظت قابل تجزیه و تحلیل
  • نتایج کنترل‌های منفی شامل محدوده کنترل تاریخی درصد سلول‌های حاوی micronucleus
  • نتایج کنترل‌های مثبت clastogen برای تأیید حساسیت سیستم برای شکست کروموزومی
  • نتایج کنترل‌های مثبت aneugen برای تأیید حساسیت سیستم برای aneugenicity
  • تعداد سلول‌های دو هسته‌ای بررسی شده حداقل 2000 سلول در هر غلظت
  • تعداد و درصد سلول‌های حاوی micronucleus برای هر غلظت
  • نتایج FISH در صورت انجام شامل درصد micronucleusهای سانترومر مثبت که نشانگر aneugen است و سانترومر منفی که نشانگر clastogen می‌باشد
  • نتیجه آزمون در شرایط با S9 و بدون S9
  • طبقه‌بندی نهایی شامل منفی یا مثبت همراه با تعیین clastogen یا aneugen
  • مهر تأیید و امضای مدیر فنی

آیا گزارش آزمون ریزهسته برای اخذ تاییدیه کافی است؟

بله. آزمایشگاه سنجش ساناژن به عنوان آزمایشگاه همکار رسمی دارای مجوز، گواهی ISO 17025 و رعایت اصول GLP می‌باشد. با این حال، طبق ISO 10993-3، یک باتری حداقلی شامل آزمون ایمز به همراه آزمون ریزهسته الزامی است.

آیا تست میکرونوکلئوس برای همه تجهیزات پزشکی قابل استفاده است؟

بله. برای مواد با سمیت سلولی بالا که کاهش CBPI بیش از 55 درصد داشته باشد، ممکن است نیاز به استفاده از غلظت‌های پایین‌تر باشد.

تفاوت بین سلول‌های TK6 و لنفوسیت انسانی در تست میکرونوکلئوس چیست؟

TK6 یک رده سلولی جاودانه با تکرارپذیری بالا است. لنفوسیت انسانی نزدیک‌ترین سیستم به انسان است اما تنوع بین داوطلبان دارد. هر دو معتبر هستند.

چرا از دو برنامه تیمار در تست میکرونوکلئوس استفاده می‌شود؟

تیمار کوتاه مدت برای شناسایی مواد با اثر مستقیم و مواد پیش کلستوژنیک استفاده می‌شود. تیمار طولانی مدت برای موادی که نیاز به زمان بیشتری دارند.

معیار پذیرش کنترل‌ها در تست میکرونوکلئوس چیست؟

کنترل منفی: درصد سلول‌های حاوی micronucleus باید کمتر از 1 تا 2 درصد و CBPI برابر 85 درصد یا بیشتر باشد.

کنترل مثبت clastogen: باید افزایش 2 تا 3 برابری ایجاد کند.

کنترل مثبت aneugen: باید افزایش 2 تا 3 برابری ایجاد کند.

آیا در تست میکرونوکلئوس گزارش برای صادرات به چین پذیرفته می‌شود؟

بله. NMPA چین دستورالعمل OECD 487 را می‌پذیرد.

چه موادی با تست میکرونوکلئوس تداخل دارند؟

مواد با سمیت سلولی بالا، مواد رنگ‌زا، مواد فلورسنت ذاتی و موادی که با سیتوکالاسین B تداخل دارند.

زمان انجام تست میکرونوکلئوس چقدر است؟

معمولاً 6 تا 8 هفته کاری.

تفاوت FISH با رنگ‌آمیزی معمولی در تست میکرونوکلئوس چیست؟

رنگ‌آمیزی معمولی فقط وجود micronucleus را نشان می‌دهد. FISH می‌تواند وجود سانترومر را نشان داده و بین clastogen و aneugen تمایز ایجاد کند.

آیا می‌توانم همزمان با تست میکرونوکلئوس سایر آزمون‌ها را سفارش دهم؟

بله. انجام همزمان آزمون‌ها باعث کاهش زمان و هزینه می‌شود.

برای مشاوره رایگان و هماهنگی ارسال نمونه، با کارشناسان ما تماس بگیرید.

📱 پیام‌رسان بله: 989900100182+

📞 تماس تلفنی: 982191010809+

✉️ پیامک: 989900100182+

سمیت-ژنی-میکرونوکلئوس