آزمون سمیت ژنی HPRT

 

الزام دریافت تأییدیه برای تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی و دارویی

خلاصه آزمون HPRT

زمینه و هدف: ارزیابی پتانسیل ژنوتوکسیک مواد و تجهیزات پزشکی یکی از الزامات اساسی در فرآیند ارزیابی زیست‌سازگاری بر اساس استاندارد ISO 10993-3 محسوب می‌شود. آزمون جهش ژنی HPRT (Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Assay) یکی از روش‌های معتبر برای شناسایی جهش‌های ژنی در سلول‌های پستانداران بوده و به‌طور گسترده در بررسی خطرات ژنتیکی ناشی از مواد شیمیایی، عصاره‌های تجهیزات پزشکی و فرآورده‌های زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرد. آزمون سمیت ژنی HPRT با ارزیابی جهش‌های ایجادشده در ژن HPRT، توانایی ماده مورد مطالعه در القای تغییرات پایدار ژنتیکی را تعیین می‌کند و به‌عنوان بخشی از راهبرد جامع ارزیابی سمیت ژنی در کنار سایر آزمون‌های ژنوتوکسیسیته به کار می‌رود.

روش انجام: آزمون سمیت ژنی HPRT، سلول‌های پستانداران نظیر CHO، V79 یا L5178Y در شرایط کنترل‌شده کشت داده شده و در معرض غلظت‌های مختلف ماده یا عصاره مورد آزمون قرار می‌گیرند. ارزیابی معمولاً در دو شرایط، شامل حضور و عدم حضور سیستم فعال‌سازی متابولیکی S9، انجام می‌شود تا امکان شناسایی ترکیباتی که پس از متابولیسم فعال می‌شوند نیز فراهم گردد. پس از پایان دوره تماس، سلول‌ها وارد مرحله بیان جهش شده و به مدت چند روز در محیط کشت نگهداری می‌شوند تا جهش‌های القاشده تثبیت شوند. سپس سلول‌ها در محیط انتخابی حاوی 6-Thioguanine کشت داده می‌شوند. تنها سلول‌هایی که در ژن HPRT دچار جهش شده‌اند قادر به رشد و تشکیل کلنی خواهند بود. به موازات آن، شاخص‌های سمیت سلولی شامل بقا، رشد نسبی و راندمان تشکیل کلنی نیز تعیین می‌شوند. استفاده از کنترل منفی، کنترل حلال و کنترل مثبت حاوی مواد جهش‌زای شناخته‌شده، اعتبار آزمون را تضمین می‌کند.

یافته‌ها و طبقه‌بندی: نتایج آزمون سمیت ژنی HPRT بر اساس فراوانی جهش (Mutation Frequency) و مقایسه آن با گروه کنترل ارزیابی می‌شود. افزایش معنی‌دار آماری و وابسته به دوز در تعداد کلنی‌های مقاوم به 6-Thioguanine نشان‌دهنده وجود اثر جهش‌زایی است. بر اساس معیارهای پذیرفته‌شده، نتایج آزمون در سه گروه طبقه‌بندی می‌شوند: «منفی» زمانی که افزایش معنی‌داری نسبت به کنترل مشاهده نشود؛ «مثبت» زمانی که افزایش پایدار، تکرارپذیر و وابسته به غلظت در فراوانی جهش مشاهده گردد؛ و «مبهم یا غیرقطعی» زمانی که پاسخ زیستی مشاهده‌شده فاقد روند مشخص یا قابلیت تکرار کافی باشد. تفسیر نهایی علاوه بر فراوانی جهش، بر اساس میزان سمیت سلولی، کیفیت پاسخ دوز-اثر و تطابق با داده‌های کنترل مثبت و منفی انجام می‌شود.

نتیجه‌گیری: تست سمیت ژنیHPRT یکی از مهم‌ترین روش‌های in vitro برای ارزیابی جهش‌های ژنی در سلول‌های پستانداران بوده و نقش کلیدی در شناسایی خطرات ژنتیکی بالقوه مواد مورد استفاده در تجهیزات پزشکی ایفا می‌کند. این آزمون توانایی بالایی در تشخیص جهش‌های نقطه‌ای و تغییرات ژنی پایدار داشته و اطلاعات ارزشمندی در خصوص ایمنی زیستی محصولات پزشکی فراهم می‌سازد. بر اساس الزامات ISO 10993-3، نتایج آزمون HPRT در کنار سایر آزمون‌های ژنوتوکسیسیته برای ارزیابی جامع ریسک ژنتیکی و حمایت از ایمنی کاربرد بالینی تجهیزات پزشکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

واژگان کلیدی: ISO 10993-3، ژنوتوکسیسیته، آزمون HPRT، جهش ژنی، سمیت ژنتیکی، تجهیزات پزشکی، سلول‌های پستانداران، 6-Thioguanine، ارزیابی زیست‌سازگاری، Mutation Frequency.

آزمون های مشابه

تصویر خلاصه آزمون

روش انجام تست سمیت ژنیHPRT

⚠️ الزامات قانونی

انجام آزمون جهش ژنی HPRT برای اخذ پروانه ساخت، تأییدیه و کد IRC از سازمان غذا و دارو جهت ورود به بازار ایران و بازارهای بین‌المللی، برای تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت (بیشتر از 24 ساعت) و تماس ایمپلنت (بیشتر از 30 روز) الزامی است. این آزمون به عنوان یکی از سه جزء اصلی باتری سمیت ژنی طبق استاندارد ISO 10993-3 (در کنار OECD 471 و OECD 473 یا 487) معرفی شده و نتایج آن برای تشخیص جهش‌های ژنی در سلول‌های پستانداران مورد پذیرش مراجع قانونی قرار می‌گیرد.

تست سمیت ژنی HPRT

آزمون HPRT یکی از سه جزء اصلی باتری سمیت ژنی طبق استاندارد ISO 10993-3 است که مشخص می‌کند محصول شما آیا باعث جهش ژنی در سلول‌های پستانداران می‌شود یا خیر. این آزمون برای تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت (بیشتر از 24 ساعت) و تماس ایمپلنت (بیشتر از 30 روز) الزامی است و بدون ارائه گزارش معتبر آن، پروانه ساخت و تأییدیه از سازمان غذا و دارو صادر نمی‌شود. آزمایشگاه سنجش ساناژن این آزمون را بر اساس استانداردهای OECD 476 و ISO 10993-3 انجام می دهد.

ISO 10993-3: استاندارد اصلی برای انجام آزمون‌های سمیت ژنی تجهیزات پزشکی. الزامات ارزیابی جهش زایی و آسیب DNA را مشخص می‌کند.

OECD 476: دستورالعمل مرجع برای انجام آزمون جهش ژنی در سلول‌های پستانداران. این آزمون برای تشخیص جهش در ژن HPRT طراحی شده است.

ISO 10993-12: اختصاص به آماده‌سازی نمونه و عصاره‌گیری. نحوه برش و آماده‌سازی نمونه‌های تجهیزات پزشکی برای انجام آزمون دقیقاً مطابق با این استاندارد انجام می‌شود.

آزمون سمیت ژنیHPRT الزامی است برای:

تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت (بیشتر از بیست و چهار ساعت تا سی روز)

تجهیزات پزشکی با تماس ایمپلنت (بیشتر از سی روز)

تجهیزات پزشکی ساخته شده از پلیمر، فلز، سرامیک و کامپوزیت که احتمال آزادسازی ترکیبات جهش‌زا دارند (مانند ایمپلنت‌های ارتوپدی، استنت‌های دارویی، دریچه‌های قلبی، پیس میکر، مواد دندانی و ارتودنسی)

محصولات آرایشی بهداشتی و دارویی که نیاز به ارزیابی سمیت ژنی دارند

آزمون سمیت ژنیHPRT الزامی نیست برای:

تجهیزات پزشکی با تماس سطحی محدود (کمتر از بیست و چهار ساعت) مانند کاتترهای کوتاه مدت، سوزن‌ها، لوله‌های تغذیه

تجهیزات پزشکی که قبلاً ترکیبات آنها به عنوان غیر جهش‌زا شناخته شده است

HPRT: یک آنزیم کلیدی در سلول که مسئول تبدیل برخی مواد (هیپوگزانتین و گوانین) به شکل قابل استفاده برای سلول است. ژن این آنزیم بر روی کروموزوم X قرار دارد.

6-TG: یک ماده سمی که در اثر تماس با آنزیم HPRT به ترکیب کشنده برای سلول تبدیل می‌شود. سلول‌هایی که آنزیم HPRT سالم دارند، در اثر این ماده می‌میرند. سلول‌هایی که ژن HPRT در آنها جهش یافته باشد، در مقابل این ماده مقاوم هستند و زنده می‌مانند.

جهش رو به جلو: نوعی جهش که باعث می‌شود یک ژن طبیعی از کار بیفتد. در آزمون HPRT، این جهش باعث از بین رفتن فعالیت آنزیم HPRT و مقاومت سلول به ماده 6-TG می‌شود.

کارایی تشکیل کلونی: درصد سلول‌هایی که در شرایط عادی (بدون ماده سمی) قادر به رشد و تشکیل کلونی هستند. این شاخص برای محاسبه نرخ یا فرکانس جهش استفاده می‌شود.

  • استاندارد مرجع: OECD 476 و ISO 10993-3
  • نوع روش: کمی – شمارش کلونی (جهش رو به جلو)
  • ردیف سلولی: سلول تخمدان همستر چینی یا سلول ریه همستر چینی (حاوی ژن HPRT)
  • شرایط انکوباسیون سلول‌ها: دمای ۳۷ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد، رطوبت مناسب، دی اکسید کربن پنج درصد
  • مدت زمان تیمار کوتاه: 4 تا 6 ساعت (با و بدون فعال کننده متابولیک)
  • مدت زمان تیمار طولانی: 1 تا 2 روز (بدون فعال کننده متابولیک)
  • دوره بیان فنوتیپی: هفت تا 10 روز
  • دوره کشت انتخابی: 10 تا 14 روز
  • فعال کننده متابولیک: مخلوط S9
  • مدت زمان انجام و گزارش: 8 تا 10 هفته کاری
  • گزارش نهایی: فقط به زبان انگلیسی
  • دامنه تشخیص: ارزیابی جهش‌های ژنی (جهش رو به جلو) در سلول‌های پستانداران

اصل عملکرد آنزیم HPRT: آنزیم HPRT مواد طبیعی (هیپوگزانتین و گوانین) را به شکل قابل استفاده برای سلول تبدیل می‌کند. ماده سمی 6-TG نیز توسط همین آنزیم به ترکیب کشنده برای سلول تبدیل می‌شود.

اصل مقاومت به 6-TG ناشی از جهش: اگر در ژن HPRT یک جهش (از کار افتادگی) رخ دهد، آنزیم HPRT ساخته نمی‌شود. در این صورت سلول قادر به تبدیل ماده سمی 6-TG نیست و در محیط حاوی 6-TG زنده می‌ماند و رشد می‌کند. فقط سلول‌های جهش یافته قادر به تشکیل کلونی در محیط انتخابی هستند.

اصل دوره بیان فنوتیپی: پس از تیمار سلول‌ها با ماده مورد آزمون، سلول‌ها به مدت 7 تا 10 روز در محیط غیرانتخابی کشت داده می‌شوند. در این مدت، سلول‌های حاوی جهش، آنزیم HPRT را از دست می‌دهند.

اصل محاسبه فرکانس جهش: فرکانس جهش برابر است با: تعداد کلونی‌های مقاوم در محیط انتخابی تقسیم بر تعداد کلونی‌های قابل رشد در محیط غیرانتخابی، ضرب در یک میلیون

تجهیزات اصلی: هود لامینار، انکوباتور دی اکسید کربن، میکروسکوپ وارونه، شمارشگر کلونی، سانتریفیوژ، فریزر 80- درجه، حمام آب، پیپت اتوماتیک، فلاسک‌های کشت سلول، پلیت‌های 100 میلی‌متری

مواد مصرفی اصلی: رده سلولی CHO یا V79، محیط کشت حاوی 10 درصد سرم، محیط انتخابی حاوی 6-TG، مخلوط S9، کنترل منفی، کنترل مثبت، بافر استریل، رنگ، تریپسین

نمونه مطابق استاندارد ISO 10993-12 آماده می‌شود. عصاره‌گیری در حلال قطبی و غیرقطبی انجام می‌شود. نسبت سطح به حجم رعایت گردیده و عصاره‌گیری در دمای 37 تا 38 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 تا 72 ساعت انجام می‌شود. سپس حداقل 3 غلظت از عصاره تهیه می‌گردد.

کشت سلولی و آماده‌سازی: سلول‌های CHO یا V79 در فلاسک کشت داده شده و به مدت 24 ساعت در انکوباتور (دمای 37 تا 38 درجه، دی اکسید کربن 5 درصد) نگهداری می‌شوند تا به مرحله رشد لگاریتمی برسند.

تیمار کوتاه مدت (4 تا 6 ساعت): سلول‌ها در حضور و عدم حضور S9 در معرض ماده آزمون قرار می‌گیرند. سپس ماده خارج شده، سلول‌ها شسته شده و در محیط کشت تازه قرار می‌گیرند.

تیمار طولانی مدت (24 تا 48 ساعت): سلول‌ها در غیاب S9 در معرض ماده آزمون قرار می‌گیرند، سپس شسته شده و در محیط کشت تازه قرار می‌گیرند.

دوره بیان فنوتیپی (7 تا 10 روز): سلول‌ها هر 2 تا 3 روز یکبار زیرکشت داده می‌شوند تا سلول‌های جهش یافته آنزیم HPRT را از دست بدهند.

کشت انتخابی: سلول‌ها در دو مجموعه کشت داده می‌شوند: محیط غیرانتخابی (برای تعیین بازده تشکیل کلونی) و محیط انتخابی حاوی 6-TG (برای تعیین تعداد کلونی‌های جهش یافته). سلول‌ها به مدت 10 تا 14 روز در انکوباتور نگهداری می‌شوند.

رنگ‌آمیزی و شمارش کلونی: کلونی‌ها رنگ‌آمیزی شده و کلونی‌های با قطر بزرگتر از 2 میلی‌متر در هر پلیت شمارش می‌شوند.

محاسبه فرکانس جهش: فرکانس جهش برابر است با میانگین کلونی‌های مقاوم در محیط انتخابی تقسیم بر میانگین کلونی‌های محیط غیرانتخابی، ضرب در ضریب رقت، ضرب در یک میلیون

نتیجه وضعیت معیار پذیرش (طبق OECD 476)
غیر جهش‌زا منفی (Negative) فرکانس جهش در محدوده کنترل منفی (تاریخی) است یا افزایش کمتر از 2 برابر کنترل منفی دارد
جهش‌زا مثبت (Positive) افزایش وابسته به غلظت (دوز-پاسخ) و از نظر آماری معنی‌دار (p < 0.05) در فرکانس جهش، با افزایش حداقل 2 تا 3 برابر نسبت به کنترل منفی

  • نکته ۱: بازده تشکیل کلونی در محیط غیرانتخابی برای هر غلظت محاسبه می‌شود. اگر سمیت سلولی باعث کاهش بازده تشکیل کلونی بیش از 50 درصد شود، آن غلظت غیرقابل قبول است.
  • نکته ۲: آزمون در دو شرایط جداگانه (با و بدون فعال کننده متابولیک S9) انجام می‌شود تا مواد پیش جهش‌زا نیز شناسایی شوند.
  • نکته ۳: نتایج مثبت در این آزمون معمولاً نیاز به تأیید با یک آزمون دیگر (مانند OECD 471 یا OECD 487) دارند (باتری حداقلی طبق استاندارد ISO 10993-3).

ارزیابی جهش ژنی در سلول پستانداران:

این آزمون به عنوان یکی از سه جزء اصلی باتری سمیت ژنی طبق استاندارد ISO 10993-3 (در کنار OECD 471 و OECD 473 یا 487) عمل می‌کند و به طور خاص جهش‌های ژنی (جهش رو به جلو) را در سلول‌های پستانداران ارزیابی می‌نماید.

پیش‌بینی سرطان‌زایی و جهش‌زایی:

جهش در ژن HPRT یک شاخص معتبر برای سرطان‌زایی بالقوه مواد است. از آنجا که این ژن بر روی کروموزوم X قرار دارد، یک جهش واحد برای از دست رفتن عملکرد کافی است.

الزامات قانونی سازمان غذا و دارو:

سازمان غذا و داروی ایران و سایر مراجع نظارتی بین‌المللی، انجام آزمون جهش ژنی HPRT را برای تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت و ایمپلنت به عنوان بخش اجباری باتری سمیت ژنی الزامی می‌دانند.

تفاوت با OECD 471: آزمون ایمز در باکتری‌ها انجام می‌شود و جهش‌های نقطه‌ای برگشتی را تشخیص می‌دهد. اما OECD 476 در سلول‌های پستانداران انجام می‌شود و جهش رو به جلو را در یک ژن ساختاری ارزیابی می‌کند. نتایج OECD 476 به فیزیولوژی پستانداران (از جمله سیستم ترمیم DNA) نزدیک‌تر است.

تفاوت با OECD 473: آزمون OECD 473 انحرافات کروموزومی ساختاری (شکست، قطعه قطعه شدن) را در سطح میکروسکوپی تشخیص می‌دهد. اما OECD 476 جهش‌های ژنی را در سطح مولکولی (تغییر در توالی DNA) تشخیص می‌دهد. هر دو آزمون مکمل یکدیگر هستند.

تفاوت با OECD 487: آزمون OECD 487 هم شکست کروموزومی و هم آنیوژنیسیته را تشخیص می‌دهد، اما جهش‌های ژنی را تشخیص نمی‌دهد. OECD 476 به طور خاص جهش‌های ژنی را ارزیابی می‌کند.

مزیت اصلی روش OECD 476: این روش جهش‌های ژنی را در سلول‌های پستانداران ارزیابی می‌کند که از نظر سیستم ترمیم DNA و متابولیسم به انسان نزدیک‌تر است و نتایج آن قابلیت تعمیم بیشتری به انسان دارد.

  • گزارش نهایی شامل موارد زیر است:
  • مشخصات دقیق نمونه (توضیحات فنی، شماره لات، تاریخ تولید)
  • شرایط عصاره‌گیری (نسبت سطح به حجم، حلال، دما، زمان) مطابق با ISO 10993-12
  • رده سلولی استفاده شده (نوع و منبع، تعداد پاساژ سلول)
  • نتایج سمیت سلولی برای تعیین محدوده غلظت‌های غیرسمی
  • غلظت‌های تست شده عصاره (حداقل 3 غلظت قابل تجزیه و تحلیل)
  • نتایج کنترل‌های منفی (محدوده فرکانس جهش در کنترل تاریخی)
  • نتایج کنترل‌های مثبت (فرکانس جهش، تأیید حساسیت سیستم)
  • بازده تشکیل کلونی در محیط غیرانتخابی (درصد)
  • تعداد کلونی‌های مقاوم به 6-TG در محیط انتخابی (به ازای هر یک میلیون سلول)
  • فرکانس جهش (در هر یک میلیون سلول) برای هر غلظت
  • نتیجه آزمون در شرایط با S9 و بدون S9
  • طبقه‌بندی نهایی: جهش‌زا (مثبت) یا غیر جهش‌زا (منفی)
  • مهر تأیید و امضای مدیر فنی

آیا گزارش آزمون HPRT آزمایشگاه سنجش ساناژن برای اخذ تاییدیه سازمان غذا و داروی ایران کافی است؟

بله. آزمایشگاه سنجش ساناژن به عنوان آزمایشگاه همکار رسمی سازمان غذا و داروی ایران دارای مجوز رسمی، گواهی ISO 17025 و رعایت اصول GLP می‌باشد. گزارش‌های صادره مستقیماً برای اخذ پروانه ساخت و تأییدیه نهایی قابل ارائه هستند. با این حال، طبق استاندارد ISO 10993-3، این آزمون به تنهایی کافی نیست و باید با یک باتری از آزمون‌ها (شامل OECD 471 و OECD 473 یا 487) تکمیل شود.

آیا آزمون HPRT به تنهایی برای اثبات عدم وجود سمیت ژنی کافی است؟

خیر. هیچ آزمون واحدی نمی‌تواند تمام مکانیسم‌های سمیت ژنی را پوشش دهد. آزمون HPRT فقط جهش‌های ژنی را تشخیص می‌دهد. یک باتری حداقلی شامل OECD 471 بعلاوه OECD 473 یا 487 بعلاوه OECD 476 الزامی است.

تفاوت بین CHO و V79 در تست سمیت ژنیHPRT چیست؟

CHO (سلول تخمدان همستر چینی) و V79 (سلول ریه همستر چینی) هر دو رده سلولی پستانداران هستند. CHO چسبندگی و رشد بهتری دارد و رایج‌تر است. استاندارد هر دو را می‌پذیرد.

چرا دوره بیان فنوتیپی (7 تا 10 روز) در تست سمیت ژنیHPRT ضروری است؟

پس از تیمار سلول‌ها، جهش در سطح DNA رخ می‌دهد اما سلول هنوز حاوی پروتئین HPRT طبیعی است. دوره بیان فنوتیپی به سلول فرصت می‌دهد تا پروتئین‌های قبلی را تخریب کرده و جهش در سطح فنوتیپی ظاهر شود.

معیار پذیرش کنترل مثبت و منفی در تست سمیت ژنیHPRT چیست؟

کنترل منفی باید فرکانس جهش در محدوده کنترل تاریخی (معمولاً 5 تا 20 جهش در هر یک میلیون سلول) داشته باشد. کنترل مثبت باید باعث افزایش 5 تا 10 برابری فرکانس جهش نسبت به کنترل منفی شود (معمولاً 100 تا 300 جهش در هر یک میلیون سلول).

آیا برای محصولات صادراتی گزارش آزمون HPRT شما پذیرفته می‌شود؟

بله. گزارش‌های آزمایشگاه سنجش ساناژن با رعایت الزامات ISO 17025 و GLP، برای ثبت محصولات در بازارهای بین‌المللی قابل ارائه است.

چه موادی با آزمون HPRT تداخل دارند؟

مواد با سمیت سلولی بالا که کاهش بازده تشکیل کلونی بیش از 50 درصد ایجاد می‌کنند، مواد مهارکننده رشد سلول و موادی که با 6-TG واکنش می‌دهند. در این موارد استفاده از دوزهای پایین‌تر توصیه می‌شود.

زمان انجام آزمون HPRT چقدر است؟

زمان انجام آزمون معمولاً 8 تا 10 هفته کاری از تاریخ دریافت نمونه تا صدور گزارش نهایی می‌باشد.

تفاوت روش با S9 و بدون S9 در تست سمیت ژنیHPRT چیست؟

روش بدون S9 برای تشخیص مواد جهش‌زای مستقیم استفاده می‌شود. روش با S9 برای تشخیص مواد پیش جهش‌زا (نیازمند متابولیسم کبدی برای فعال شدن) استفاده می‌شود.

آیا می‌توانم تست سمیت ژنیHPRT را همزمان سایر آزمون‌های زیست‌سازگاری نیز سفارش دهم؟

بله. انجام همزمان آزمون‌ها باعث کاهش زمان و هزینه می‌شود.

برای مشاوره رایگان و هماهنگی ارسال نمونه، با کارشناسان ما تماس بگیرید.

📱 پیام‌رسان بله: 989900100182+

📞 تماس تلفنی: 982191010809+

✉️ پیامک: 989900100182+

  • سمیت-ژنی-hprt
  • تست hprt
  • تست سمیت ژنی hprt