آزمون سمیت سلولی XTT

 

الزام دریافت تأییدیه برای تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی و دارویی

خلاصه آزمون

زمینه و هدف: آزمون سمیت سلولی XTT یکی از روش‌های کمی و حساس ارزیابی سمیت سلولی است که بر پایه اندازه‌گیری فعالیت متابولیکی سلول‌های زنده انجام می‌شود. این آزمون در مطالعات زیست‌سازگاری تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، فرآورده‌های دندانپزشکی، مواد زیستی و سایر محصولات دارای تماس با بدن کاربرد گسترده‌ای دارد. بر اساس الزامات ISO 10993-5، ارزیابی سمیت سلولی یکی از مراحل اساسی بررسی ایمنی زیستی محصولات پزشکی محسوب می‌شود. آزمون XTT به دلیل دقت بالا، سهولت اجرا و قابلیت ارائه نتایج کمی، به عنوان یکی از روش‌های پرکاربرد در سنجش زنده‌مانی سلولی شناخته می‌شود. هدف از این آزمون تعیین میزان تأثیر نمونه مورد ارزیابی بر فعالیت متابولیکی سلول‌ها و شناسایی اثرات سیتوتوکسیک احتمالی ناشی از مواد آزادشونده از محصول است. نتایج حاصل از این آزمون می‌تواند اطلاعات ارزشمندی در خصوص ایمنی محصول و احتمال ایجاد آسیب سلولی در شرایط استفاده واقعی فراهم نماید.

روش انجام: در تست سمیت سلولی XTT ابتدا سلول‌های مناسب، معمولاً سلول‌های فیبروبلاستی پستانداران، در پلیت‌های کشت سلولی کشت داده می‌شوند تا به تراکم مطلوب برسند. سپس سلول‌ها در معرض نمونه مورد آزمون یا عصاره تهیه‌شده از محصول قرار می‌گیرند. همزمان کنترل مثبت و کنترل منفی نیز جهت اعتبارسنجی آزمون استفاده می‌شوند. پس از پایان دوره تماس، معرف XTT به چاهک‌های حاوی سلول اضافه می‌شود. سلول‌های زنده دارای فعالیت متابولیکی قادر هستند معرف XTT را توسط آنزیم‌های میتوکندریایی احیا کرده و یک محصول رنگی محلول در محیط کشت تولید نمایند. شدت رنگ ایجادشده متناسب با تعداد سلول‌های زنده و میزان فعالیت متابولیکی آن‌ها است. پس از طی دوره انکوباسیون، جذب نوری نمونه‌ها توسط دستگاه میکروپلیت‌ریدر اندازه‌گیری شده و درصد زنده‌مانی سلولی نسبت به کنترل منفی محاسبه می‌شود.

یافته‌ها و طبقه‌بندی: نتایج آزمون XTT نشان می‌دهد که میزان جذب نوری به طور مستقیم با تعداد سلول‌های زنده و فعالیت متابولیکی آن‌ها ارتباط دارد. در نمونه‌های دارای زیست‌سازگاری مناسب، شدت رنگ ایجادشده مشابه کنترل منفی بوده و کاهش معنی‌داری در فعالیت متابولیکی سلول‌ها مشاهده نمی‌شود. در مقابل، مواد دارای سمیت سلولی موجب کاهش فعالیت آنزیم‌های سلولی، افت تولید محصول رنگی و کاهش جذب نوری می‌شوند. این کاهش بیانگر آسیب سلولی یا مرگ سلولی ناشی از تماس با نمونه است. بر اساس معیارهای پذیرش ISO 10993-5، زنده‌مانی سلولی بیشتر از70% نسبت به کنترل منفی معمولاً به عنوان غیرسیتوتوکسیک در نظر گرفته می‌شود. در صورتی که زنده‌مانی سلولی کمتر از70% باشد، نمونه دارای اثر سیتوتوکسیک تلقی می‌شود. شدت کاهش زنده‌مانی می‌تواند نشان‌دهنده میزان سمیت نمونه و تأثیر آن بر سلامت سلول‌ها باشد.

نتیجه‌گیری: آزمون سمیت سلولی XTT یک روش استاندارد، حساس و قابل اعتماد برای ارزیابی زنده‌مانی و فعالیت متابولیکی سلول‌ها در مطالعات زیست‌سازگاری است. این آزمون امکان اندازه‌گیری کمی پاسخ سلولی را فراهم کرده و قادر است اثرات سیتوتوکسیک ناشی از مواد آزادشونده از تجهیزات پزشکی و مواد زیستی را با دقت بالا شناسایی کند. استفاده از این روش مطابق الزامات ISO 10993-5 نقش مهمی در ارزیابی ایمنی محصولات، کنترل کیفیت و اخذ مجوزهای قانونی ایفا می‌کند و یکی از ابزارهای مهم در غربالگری اولیه زیست‌سازگاری محصولات پزشکی محسوب می‌شود.

واژگان کلیدی: سمیت سلولی، XTT، ISO 10993-5، زیست‌سازگاری، زنده‌مانی سلولی، فعالیت متابولیکی، سلول‌های فیبروبلاستی، آزمون تترازولیوم، تجهیزات پزشکی، کنترل مثبت، کنترل منفی، ارزیابی ایمنی زیستی

آزمون های مشابه

تصویر خلاصه آزمون

خلاصه تست سمیت سلولی XTT

⚠️ الزامات قانونی

انجام آزمون XTT برای اخذ پروانه ساخت، کد IRC و تاییدیه سازمان غذا و دارو جهت ورود به بازار ایران و بازارهای بین‌المللی الزامی است. این آزمون به عنوان یک روش کمی برای ارزیابی سمیت سلولی در استاندارد ISO 10993-5 معرفی شده و نتایج آن برای اثبات عدم وجود سمیت سلولی تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی بهداشتی و دارویی مورد پذیرش مراجع قانونی قرار می‌گیرد. این آزمون بر اساس ISO 10993-5 و تحت نظارت ISO 17025 (آزمایشگاه همکار معتمد) انجام می‌شود. نتایج آن قابل استناد برای سازمان غذا و داروی ایران و قابل ارائه برای اخذ تاییدیه FDA و کد IRC می‌باشد.

تست سمیت سلولی XTT

در آزمون سمیت سلولی XTT، عصاره حاصل از نمونه یا خود ماده مستقیماً به لایه سلول‌های زنده اضافه می‌شود. سپس محلول XTT که یک رنگ زرد است به سلول‌ها افزوده می‌گردد. آنزیم‌های موجود در سلول‌های زنده، این رنگ را به محصولی نارنجی‌رنگ تبدیل می‌کنند. هرچه سلول‌های زنده بیشتری وجود داشته باشد، رنگ نارنجی پررنگ‌تر خواهد بود. شدت رنگ با دستگاه الایزا ریدر اندازه‌گیری شده و درصد زنده مانی سلول‌ها محاسبه می‌شود. این آزمون برای مواد جاذب آب، مواد دارای مواد سمی با وزن مولکولی بالا و محصولات آرایشی بهداشتی کاربرد دارد و جزء حداقل آزمون‌های الزامی برای اخذ تاییدیه از سازمان غذا و دارو می‌باشد. 

ISO 10993-5: این استاندارد مرجع اصلی برای انجام آزمون XTT می‌باشد. سلول‌های زنده باعث تغییر رنگ محلول XTT از زرد به نارنجی می‌شوند. کاهش درصد زنده مانی سلول‌ها نسبت به کنترل منفی، به عنوان اثر سمیت سلولی در نظر گرفته می‌شود.

ISO 10993-12: این استاندارد به آماده‌سازی نمونه اختصاص دارد. نحوه برش، ضدعفونی و آماده‌سازی نمونه‌های مختلف و همچنین شرایط عصاره‌گیری برای انجام آزمون XTT، دقیقاً مطابق با این استاندارد انجام می‌شود.

مواردی که تست سمیت سلولی XTT الزامی است:

  • تمامی تجهیزات پزشکی که نیاز به ارزیابی کمی سمیت سلولی دارند
  • مواد جاذب آب مانند هیدروژل‌ها و پانسمان‌ها
  • عصاره‌های حاصل از تجهیزات پزشکی
  • مواد دندانپزشکی مانند سمان‌ها و کامپوزیت‌ها
  • محصولات آرایشی بهداشتی مانند کرم‌ها، لوسیون‌ها و شامپوها

مواردی که تست سمیت سلولی XTT الزامی نیست:

  • موادی که دارای رنگ یا کدورت شدید هستند
  • موادی که خود با کیت XTT واکنش شیمیایی می‌دهند

XTT: یک ماده زرد رنگ که در آب حل می‌شود.

فورمازان: محصول نارنجی رنگی که در اثر فعالیت سلول‌های زنده از XTT تولید می‌شود.

زنده مانی: درصد سلول‌های زنده در نمونه نسبت به نمونه کنترل که از طریق اندازه‌گیری شدت رنگ نارنجی تعیین می‌شود.

  • استاندارد مرجع: ISO 10993-5
  • نوع روش: کمی – رنگی سنجی
  • شرایط انکوباسیون با XTT: دمای ۳۷ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد همراه با ۵ درصد دی اکسید کربن به مدت ۲ تا ۴ ساعت
  • زمان و نحوه گواهی و گزارش‌دهی: ۱۰ تا ۱۵ روز کاری – گزارش کامل نتایج به زبان انگلیسی
  • دامنه تشخیص: اندازه‌گیری کمی درصد زنده مانی سلول‌ها

اصل آنزیمی: سلول‌های زنده ماده XTT را از زرد به نارنجی تبدیل می‌کنند. هر چه سلول‌های زنده بیشتر باشند، رنگ نارنجی پررنگ‌تر است.

اصل رنگ سنجی: شدت رنگ نارنجی توسط دستگاه اندازه‌گیری می‌شود. هر چه جذب نوری بالاتر باشد، زنده مانی سلول‌ها بیشتر است.

اصل کمی: روش XTT نتایج کمی و دقیقی به صورت درصد زنده مانی ارائه می‌دهد.

مزیت نسبت به MTT: در روش XTT محصول رنگی مستقیماً محلول است و بر خلاف روش MTT نیازی به مرحله حل کردن کریستال‌ها ندارد. این امر باعث کاهش خطا و سرعت بیشتر می‌گردد.

تجهیزات اصلی: هود لامینار، انکوباتور ۳۷ تا ۳۸ درجه با ۵ درصد دی اکسید کربن، میکروسکوپ وارونه، دستگاه الایزا ریدر، فریزر ۸۰- درجه، سانتریفیوژ، پیپت اتوماتیک چند کاناله، دستگاه شمارش سلول

مواد مصرفی: رده سلولی L-929 مطابق ISO 10993-5، محیط کشت دارای ۱۰ درصد سرم، محیط عصاره‌گیری بدون سرم یا نرمال سالین، پلیت ۹۶ خانه‌ای شفاف، کیت XTT، کنترل منفی، کنترل مثبت

نمونه مطابق با ISO 10993-12 آماده می‌شود. برای روش الوشن، نمونه در لوله استریل قرار گرفته و محیط عصاره‌گیری به آن اضافه می‌شود. عصاره‌گیری در دمای ۳۷ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد و زمان مشخص انجام می‌شود. عصاره جمع آوری شده و در صورت وجود ذرات معلق، سانتریفیوژ می‌گردد. سپس رقت‌های مختلفی از عصاره تهیه می‌شود.

کشت سلولی: سلول‌های L-929 در پلیت ۹۶ خانه‌ای کشت داده می‌شوند و به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور نگهداری می‌شوند.

اضافه کردن عصاره به سلول‌ها: محیط کشت قدیمی خارج شده و عصاره با رقت‌های مختلف به خانه‌ها اضافه می‌شود. هر رقت در ۴ تا ۶ تکرار تست می‌شود.

انکوباسیون اولیه: پلیت‌ها به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۷ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد و ۵ درصد دی اکسید کربن قرار می‌گیرند.

اضافه کردن معرف XTT: محلول XTT به هر خانه اضافه می‌شود.

انکوباسیون نهایی: پلیت‌ها به مدت ۲ تا ۴ ساعت در انکوباتور قرار می‌گیرند.

اندازه‌گیری جذب نوری: جذب نوری هر خانه توسط دستگاه الایزا ریدر اندازه‌گیری می‌شود.

ارزیابی بر اساس درصد زنده مانی سلول‌ها در مقایسه با کنترل منفی (100% زنده مانی) انجام می‌شود. درصد زنده مانی به صورت زیر محاسبه می‌گردد:

درصد زنده مانی = (جذب نوری نمونه ÷ جذب نوری کنترل منفی) × 100

درجه وضعیت درصد زنده مانی
0 عاری از سمیت بیشتر یا مساوی 80%
1 سمیت خفیف 70% تا 79%
2 سمیت متوسط 50% تا 69%
3 سمیت نسبتاً شدید 30% تا 49%
4 سمیت شدید کمتر از 30%

نکته مهم: بر اساس ISO 10993-5، کاهش زنده مانی به کمتر از 70% نسبت به کنترل منفی، به عنوان اثر سمیت سلولی واضح در نظر گرفته می‌شود که معادل درجه 2 یا بالاتر می‌باشد.

غربالگری اولیه سمیت:

این آزمون یکی از دقیق‌ترین روش‌های سلسله مراتب آزمون‌های زیست‌سازگاری است. به دلیل کمی بودن نتایج و حساسیت بالا، به عنوان یک غربالگر دقیق برای مقایسه سمیت سلولی مواد مختلف عمل می‌کند.

پیش‌بینی رفتار بیولوژیکی در بدن:

این آزمون یکی از قابل اعتمادترین روش‌ها برای پیش‌بینی سمیت سلولی در بدن است. نمونه‌هایی که درصد زنده مانی سلول‌ها را کاهش می‌دهند، در تماس با بافت زنده بدن واکنش شدید ایجاد خواهند کرد.

الزامات قانونی سازمان غذا و دارو:

سازمان غذا و داروی ایران و مراجع بین‌المللی انجام این آزمون را برای کلیه تجهیزات پزشکی که نیاز به ارزیابی کمی سمیت سلولی دارند، الزامی می‌دانند.

تفاوت با روش MTT: در روش XTT محصول رنگی مستقیماً در آب محلول است و مرحله حل کردن کریستال‌ها حذف می‌شود که باعث کاهش خطا و سرعت بیشتر می‌گردد.

تفاوت با روش آگار دیفیوژن: روش XTT یک روش کمی است که درصد زنده مانی را محاسبه می‌کند.

تفاوت با روش تماس مستقیم: روش XTT معمولاً همراه با روش الوشن انجام می‌شود و برای عصاره‌های حاصل از هر نوع ماده (جامد، مایع، کرم) قابل استفاده است.

مزیت اصلی روش XTT: این روش سریع‌ترین و دقیق‌ترین روش کمی برای ارزیابی سمیت سلولی است.

  • مشخصات دقیق نمونه شامل توضیحات فنی، شماره لات و تاریخ تولید
  • رده سلولی استفاده شده L-929
  • شرایط عصاره‌گیری شامل دما، زمان و نوع محیط عصاره‌گیری
  • تاریخ شروع و پایان آزمون
  • شرح روش آزمون مطابق با ISO 10993-5 (روش XTT)
  • جدول درصد زنده مانی برای هر رقت
  • درجه نهایی سمیت
  • تصاویر میکروسکوپی از کنترل منفی، کنترل مثبت و نمونه
  • مهر تایید و امضای مدیر فنی

آیا آزمون XTT با آزمون MTT قابل جایگزینی است؟

بله، هر دو آزمون در استاندارد ISO 10993-5 پذیرفته شده‌اند. روش XTT به دلیل حذف مرحله حل کردن کریستال‌ها، سریع‌تر و کم خطاتر است.

چرا از عامل جفت کننده در تست سمیت سلولی XTT استفاده می‌شود؟

برای تسریع واکنش. بدون آن، واکنش بسیار کند بوده و ممکن است نتایج دقیقی حاصل نشود.

در تست سمیت سلولی XTT مدت زمان انکوباسیون با XTT چقدر باید باشد؟

زمان استاندارد ۲ تا ۴ ساعت می‌باشد.

آیا می‌توان از تست سمیت سلولی XTT برای مواد جامد بدون عصاره‌گیری استفاده کرد؟

به طور معمول، روش XTT همراه با روش الوشن انجام می‌شود.

آیا رنگ یا کدورت عصاره بر نتیجه تست سمیت سلولی XTT تأثیر می‌گذارد؟

بله، یکی از محدودیت‌های روش XTT حساسیت به رنگ و کدورت عصاره است.

آیا در تست سمیت سلولی XTT می‌توان از رده‌های سلولی دیگر به جای L-929 استفاده کرد؟

بله، استاندارد ISO 10993-5 استفاده از سایر رده‌های سلولی را مجاز می‌داند. اما برای پذیرش توسط سازمان غذا و دارو، استفاده از L-929 توصیه می‌شود.

هزینه و زمان انجام تست سمیت سلولی XTT چقدر است؟

زمان انجام آزمون معمولاً ۱۰ تا ۱۵ روز کاری تا صدور گزارش نهایی می‌باشد. برای استعلام دقیق هزینه، با واحد پشتیبانی تماس بگیرید.

برای مشاوره رایگان و هماهنگی ارسال نمونه، با کارشناسان ما تماس بگیرید.

📱 پیام‌رسان بله: 989900100182+

📞 تماس تلفنی: 982191010809+

✉️ پیامک: 989900100182+

  • تست سمیت سلولی ایکس تی تی
  • تست سمیت سلولی
  • تست سیتوتوکسیسیتی
  • تست سایتوتوکسیسیتی
  • تست سمیت یاخته ای

⚠️ تکمیل و ارسال کلیه مدارک و فرم‌های مورد نیاز پیش از ارسال نمونه به آزمایشگاه الزامی است. لطفاً مدارک را به‌صورت کامل و صحیح ارسال نمایید. در صورت وجود نقص یا مغایرت در اطلاعات، فرآیند پذیرش نمونه، بررسی فنی و شروع آزمون با تأخیر مواجه خواهد شد.

مدارک مورد نیاز قبل از ارسال نمونه به آزمایشگاه

⚠️ پیش از ارسال نمونه، لطفاً الزامات و شرایط حمل، نگهداری و بسته‌بندی نمونه را به دقت مطالعه نموده و جهت اطمینان از پذیرش صحیح نمونه، با واحد پذیرش آزمایشگاه هماهنگی لازم را انجام دهید.

شرایط ارسال نمونه به آزمایشگاه

⚠️ جهت دریافت هزینه دقیق و به‌روز آزمون‌ها، لطفاً فرم درخواست آزمون را از طریق پیام‌رسان بله یا ایمیل برای آزمایشگاه ارسال نمایید. درخواست شما توسط کارشناسان فنی بررسی شده و هزینه نهایی بر اساس نوع آزمون، تعداد نمونه‌ها و الزامات مطالعه اعلام خواهد شد.

استعلام هزینه آزمون

⚠️ گزارش نهایی آزمون پس از تکمیل تمامی مراحل آزمایش، بررسی نتایج و تأیید واحد کنترل کیفیت، در کوتاه‌ترین زمان ممکن صادر شده و حداکثر ظرف 10 روز کاری در قالب گزارش رسمی انگلیسی به متقاضی تحویل خواهد شد.

گزارش نهایی آزمون