آزمون حساسیت‌زایی پوستی – LLNA

الزام دریافت تأییدیه برای تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی و دارویی

خلاصه آزمون

زمینه و هدف: حساسیت‌زایی پوستی یکی از مهم‌ترین جنبه‌های ارزیابی زیست‌سازگاری تجهیزات پزشکی است که به شناسایی توانایی مواد در ایجاد واکنش‌های آلرژیک تأخیری کمک می‌کند. استاندارد ISO 10993-10 ارزیابی حساسیت‌زایی را به‌عنوان بخشی ضروری از برنامه ارزیابی بیولوژیکی تجهیزات پزشکی معرفی کرده است. آزمون LLNA یا Local Lymph Node Assay یک روش معتبر و پذیرفته‌شده برای شناسایی مواد حساسیت‌زا محسوب می‌شود که بر پایه اندازه‌گیری تکثیر سلول‌های لنفاوی در گره‌های لنفاوی موضعی بنا شده است. این روش به‌عنوان جایگزینی علمی برای آزمون‌های سنتی مبتنی بر خوکچه هندی توسعه یافته و با کاهش تعداد حیوانات مورد استفاده، امکان ارزیابی کمی پتانسیل حساسیت‌زایی مواد را فراهم می‌سازد. هدف از تست حساسیت‌ زایی گره لنفاوی موضعی موش تعیین ظرفیت ماده یا عصاره استخراجی محصول پزشکی در تحریک سیستم ایمنی و القای پاسخ حساسیتی پوستی است.

روش انجام: در تست حساسیت‌ زایی LLNA از موش‌های ماده جوان، معمولاً از سویه CBA استفاده می‌شود. حیوانات تحت شرایط استاندارد نگهداری شده و نمونه مورد آزمون در غلظت‌های مختلف به‌صورت موضعی بر روی سطح خارجی هر دو گوش حیوان اعمال می‌شود. این فرایند معمولاً به مدت سه روز متوالی انجام می‌گیرد. پس از دوره مواجهه، زمان کافی برای فعال شدن سیستم ایمنی در نظر گرفته می‌شود و سپس گره‌های لنفاوی تخلیه‌کننده ناحیه گوش برداشت می‌شوند. شاخص اصلی ارزیابی در این آزمون، میزان تکثیر لنفوسیت‌ها در گره‌های لنفاوی است که از طریق روش‌های مختلف اندازه‌گیری سلولی تعیین می‌شود. داده‌های حاصل با گروه کنترل مقایسه شده و شاخص تحریک (Stimulation Index یا SI) برای هر غلظت محاسبه می‌شود. این شاخص بیانگر میزان فعال‌سازی سیستم ایمنی در پاسخ به ماده مورد آزمون است.

یافته‌ها و طبقه‌بندی: نتایج تست حساسیت‌ زایی LLNA بر اساس میزان افزایش تکثیر سلول‌های لنفاوی نسبت به گروه کنترل تفسیر می‌شود. زمانی که مقدار شاخص تحریک برابر یا بیشتر از 3 باشد، ماده مورد آزمون دارای پتانسیل حساسیت‌زایی تلقی می‌شود. در مقابل، اگر مقدار SI کمتر از 3 باشد، ماده به‌عنوان غیرحساسیت‌زا طبقه‌بندی می‌شود. علاوه بر تعیین وجود یا عدم وجود حساسیت‌زایی، این آزمون امکان برآورد قدرت نسبی مواد حساسیت‌زا را نیز فراهم می‌کند. داده‌های کمی حاصل از LLNA به ارزیابی دقیق‌تر ریسک زیستی و مقایسه مواد مختلف کمک می‌نماید. به دلیل تکرارپذیری بالا، حساسیت مناسب و قابلیت تحلیل آماری، این روش یکی از پرکاربردترین آزمون‌های ارزیابی حساسیت‌زایی در حوزه تجهیزات پزشکی و مواد شیمیایی محسوب می‌شود.

نتیجه‌گیری: آزمون حساسیت زایی LLNA یکی از روش‌های استاندارد و علمی برای ارزیابی حساسیت‌زایی پوستی در چارچوب ISO 10993-10 است که با اندازه‌گیری پاسخ تکثیری سلول‌های لنفاوی، توانایی مواد در القای واکنش‌های آلرژیک را تعیین می‌کند. این روش در مقایسه با آزمون‌های سنتی حیوانی، از دقت، حساسیت و قابلیت کمی‌سازی بیشتری برخوردار بوده و در عین حال موجب کاهش تعداد حیوانات مورد استفاده می‌شود. نتایج حاصل از LLNA نقش مهمی در ارزیابی ایمنی زیستی تجهیزات پزشکی، مدیریت ریسک و تضمین حفاظت از مصرف‌کنندگان ایفا می‌کند و به همین دلیل به‌عنوان یکی از روش‌های مرجع در مطالعات حساسیت‌زایی شناخته می‌شود.

واژگان کلیدی: LLNA، Local Lymph Node Assay، حساسیت‌زایی پوستی، ISO 10993-10، زیست‌سازگاری، گره لنفاوی موضعی، شاخص تحریک (SI)، تکثیر لنفوسیت‌ها، ارزیابی ایمنی زیستی، تجهیزات پزشکی.

آزمون های مشابه

تصویر خلاصه آزمون

⚠️ الزامات قانونی

انجام آزمون حساسیت‌زایی پوستی به روش LLNA برای اخذ پروانه ساخت تجهیزات پزشکی با تماس مکرر یا طولانی مدت با پوست، محصولات آرایشی بهداشتی و مواد شیمیایی الزامی است. این آزمون برای دریافت کد IRC از سازمان غذا و داروی ایران و همچنین برای ورود به بازار داخلی و صادرات به کشورهای هدف ضروری می‌باشد. روش LLNA به عنوان جایگزین روش‌های حیوانی قبلی شامل Buehler و GPMT به دلیل کاهش مصرف حیوانات، کاهش درد و رنج و ارائه نتایج کمی و عینی توسط OECD پذیرفته شده است.

تست حساسیت‌زایی – LLNA

هدف

ارزیابی پتانسیل حساسیت‌زایی مواد از طریق اندازه‌گیری تکثیر لنفوسیت‌ها در غدد لنفاوی منطقه‌ای پس از 3 روز اعمال موضعی ماده آزمون بر روی گوش موش، محاسبه شاخص تحریک و مقایسه با مقدار بحرانی، تعیین قدرت حساسیت‌زایی بر اساس EC3 یا EC1/6، طبقه‌بندی ماده در رده‌های فاقد حساسیت‌زایی تا فوق العاده قوی، پیش‌بینی رفتار بیولوژیکی محصول در تماس مکرر با پوست انسان، و ارائه مستندات معتبر برای اخذ تاییدیه سازمان غذا و دارو، پروانه ساخت و کد IRC

منابع رسمی

ISO 10993-10: این استاندارد مرجع اصلی برای انجام آزمون حساسیت‌زایی پوستی تجهیزات پزشکی می‌باشد. روش LLNA به عنوان یک روش جایگزین معتبر برای تشخیص پتانسیل حساسیت‌زایی مواد تشریح شده است که از موش به جای خوکچه هندی استفاده می‌کند و تکثیر لنفوسیت‌ها در غدد لنفاوی را به عنوان شاخص کمی اندازه‌گیری می‌نماید.

OECD TG 429: این استاندارد مرجع اصلی برای روش LLNA با استفاده از مواد رادیواکتیو می‌باشد. در این روش، تیمیدین نشاندار شده با تریتیوم برای اندازه‌گیری تکثیر لنفوسیت‌ها به کار می‌رود.

OECD TG 442A: این استاندارد روش بدون مواد رادیواکتیو مبتنی بر اندازه‌گیری ATP در غدد لنفاوی به عنوان شاخص تکثیر سلولی می‌باشد.

OECD TG 442B: این استاندارد روش بدون مواد رادیواکتیو مبتنی بر اندازه‌گیری جذب BrdU با استفاده از تکنیک ELISA می‌باشد.

دامنه کاربرد

آزمون حساسیت زایی الزامی است:

تجهیزات با تماس مکرر با پوست شامل چسب‌های پزشکی، دستکش، پوشک، نوارچسب
تجهیزات با تماس طولانی مدت با پوست شامل مانیتورهای قابل حمل، حسگرهای پوستی
محصولات آرایشی بهداشتی شامل کرم، لوسیون، شامپو، مواد شوینده
مواد اولیه شیمیایی و پلیمری
مواد دارویی با تماس پوستی

آزمون حساسیت زایی الزامی نیست:

تماس دهنده سطحی کوتاه مدت کمتر از 24 ساعت بدون سابقه حساسیت‌زایی شناخته شده
موادی که قبلاً به عنوان حساسیت‌زای قوی یا شدید در منابع معتبر طبقه‌بندی شده‌اند
تجهیزات با تماس سطحی با پوست سالم و مدت تماس کمتر از یک دقیقه

تعاریف

حساسیت‌زایی پوستی: پاسخ ایمنی اکتسابی و اختصاصی که پس از تماس مکرر با یک ماده آلرژن ایجاد می‌شود. این پاسخ شامل فاز القا و فاز التهابی می‌باشد

روش LLNA: روشی که تکثیر لنفوسیت‌ها در غدد لنفاوی منطقه‌ای را پس از تماس مکرر با ماده آزمون اندازه‌گیری می‌کند. این روش شاخص کمی و عینی از پاسخ ایمنی ارائه می‌دهد و فاز القا را اندازه‌گیری می‌کند

شاخص تحریک: نسبت تکثیر لنفوسیت‌ها در گروه آزمون به گروه کنترل منفی. SI برابر 3 یا بیشتر نشانه پاسخ مثبت حساسیت‌زایی است

EC3: غلظت مؤثری از ماده آزمون که باعث افزایش 3 برابری تکثیر لنفوسیت‌ها می‌شود. EC3 برای ارزیابی قدرت حساسیت‌زایی و طبقه‌بندی ماده استفاده می‌شود

BrdU: آنالوگ نوکلئوزیدی که در سلول‌های در حال تقسیم جایگزین تیمیدین می‌شود. مقدار جذب BrdU با تکنیک ELISA اندازه‌گیری می‌شود

DA: روش اندازه‌گیری ATP در غدد لنفاوی به عنوان شاخص تعداد سلول‌های زنده و تکثیر یافته

چکیده اطلاعات

استاندارد مرجع: ISO 10993-10 و OECD TG 429 روش رادیواکتیو و OECD TG 442A روش DA و OECD TG 442B روش BrdU-ELISA

روش آزمون: LLNA ارزیابی تکثیر لنفوسیت‌ها در غدد لنفاوی موش

سیستم آزمون: موش ماده نژاد CBA/J یا BALB/c، سن 8 تا 12 هفته، وزن 20 تا 30 گرم

تعداد حیوانات: حداقل 20 موش شامل 3 گروه دوز ماده آزمون و 1 گروه کنترل منفی، هر گروه حداقل 4 موش

فاز القا مدت کل 3 روز: روزهای 1، 2 و 3 اعمال موضعی 25 میکرولیتر ماده آزمون با غلظت‌های مختلف بر روی پشت هر دو گوش

کنترل منفی: حلال ماده آزمون با همان حجم و روش

روز 4 ارزیابی به 3 روش:

TG 429 روش رادیواکتیو: تزریق درون صفاقی تیمیدین نشاندار با تریتیوم، 5 ساعت بعد حیوان کشته شده، غدد لنفاوی برداشته شده و رادیواکتیویته اندازه‌گیری می‌شود
TG 442A روش DA: غدد لنفاوی برداشته شده، ATP استخراج و با لومینسانس اندازه‌گیری می‌شود
TG 442B روش BrdU-ELISA: تزریق درون صفاقی BrdU، 24 ساعت بعد حیوان کشته شده، غدد لنفاوی برداشته شده و جذب BrdU با ELISA اندازه‌گیری می‌شود

زمان کل آزمون: 5 تا 7 روز

زمان گزارش نهایی: 15 تا 20 روز کاری پس از تحویل نمونه

گزارش نهایی: فقط به زبان انگلیسی صادر می‌شود

اصول کلی

روش LLNA: یک روش استاندارد برای تشخیص پتانسیل حساسیت‌زایی مواد با استفاده از موش به جای خوکچه هندی می‌باشد. مزایا: دوره کوتاه‌تر 5 تا 7 روز، مصرف کمتر حیوان 20 تا 30 موش، عدم استفاده از ادجوانت، ارائه نتایج کمی و عینی

اصل روش: ماده آزمون به مدت 3 روز متوالی بر روی پشت هر دو گوش موش اعمال می‌شود. ماده از طریق پوست جذب شده و اگر حساسیت‌زا باشد، باعث تکثیر لنفوسیت‌های T در غدد لنفاوی می‌گردد. در روز 4 میزان تکثیر لنفوسیت‌ها اندازه‌گیری می‌شود

روش رادیواکتیو: تزریق تیمیدین نشاندار با تریتیوم، 5 ساعت بعد حیوان کشته شده، غدد لنفاوی خارج و رادیواکتیویته با شمارنده سوسوزنی اندازه‌گیری می‌شود

روش DA: غدد لنفاوی خارج شده، ATP استخراج و با لومینسانس اندازه‌گیری می‌شود. ATP به عنوان شاخص تعداد سلول‌های زنده عمل می‌کند

روش BrdU-ELISA: تزریق BrdU، 24 ساعت بعد حیوان کشته شده، غدد لنفاوی خارج و میزان جذب BrdU با تکنیک ELISA اندازه‌گیری می‌شود

شاخص تحریک: SI برابر تکثیر لنفوسیت‌ها در گروه ماده آزمون تقسیم بر گروه کنترل منفی. مقدار بحرانی برای روش TG 429 برابر 3، برای TG 442A برابر 1/8 و برای TG 442B برابر 1/6 است

EC3 : مقدار EC3 یا EC1/6 برای تعیین قدرت حساسیت‌زایی ماده محاسبه می‌شود. EC3 پایین‌تر نشان‌دهنده حساسیت‌زایی قوی‌تر است

تجهیزات و مواد مصرفی

تجهیزات اصلی: دستگاه تراش برقی، انکوباتور 37 تا 38 درجه سانتی‌گراد، هود لامینار، ترازوی دقیق، پی‌هاش متر، سانتریفیوژ، شمارنده سوسوزنی برای روش TG 429، لومینومتر برای روش TG 442A، دستگاه ELISA Reader برای روش TG 442B، دوربین دیجیتال، فریزر، میکروسکوپ نوری

مواد مصرفی: موش ماده نژاد CBA/J یا BALB/c سن 8 تا 12 هفته وزن 20 تا 30 گرم، حلال‌های مناسب، بافر فسفات استریل، تیمیدین نشاندار با تریتیوم برای روش TG 429، BrdU برای روش TG 442B، کیت ELISA مخصوص BrdU، کیت ATP Bioluminescence برای روش TG 442A، تری کلرواستیک اسید 10 درصد، اتانول 70 درصد، سواب پنبه‌ای استریل، لوله‌های میکروسانتریفیوژ، پلیت 96 خانه، پیپت اتوماتیک، نوک پیپت استریل

آماده‌سازی نمونه

بررسی اولیه:

pH ماده مایع یا عصاره آبی ماده جامد اندازه‌گیری می‌شود. در صورت pH کمتر از 2/5 یا بیشتر از 11/5، ماده ذاتاً تحریک‌کننده بوده و نتایج حساسیت‌زایی قابل تفسیر نیست مگر اینکه با رقت مناسب یا خنثی‌سازی به محدوده 2/5 تا 11/5 برسد.

آماده‌سازی غلظت‌های ماده آزمون:

حداقل 3 غلظت غیرمُحرک (non-irritating) از ماده آزمون آماده می‌شود. انتخاب غلظت‌ها براساس مطالعه تعیین دامنه (Range-finding study) در موش‌های جداگانه انجام می‌شود. بالاترین غلظت باید باعث تحریک خفیف (نمره تحریک 1 یا 2) شود اما نه تحریک شدید. غلظت‌های پایین‌تر سریال رقت (مثلاً 1:2، 1:5، 1:10) تهیه می‌شوند.
حلال‌های توصیه شده: استون/روغن زیتون (نسبت 4:1)، اتانول/آب (نسبت 3:1)، دی‌متیل سولفوکسید (DMSO) رقیق شده، نرمال سالین، روغن گیاهی. انتخاب حلال باید براساس حلالیت ماده آزمون و عدم تحریک‌کنندگی حلال خالص باشد.
مواد جامد و مایع: ماده در حلال انتخاب شده حل می‌شود تا غلظت‌های مورد نظر (معمولاً 5، 10، 25، 50 درصد یا براساس dosis per skin area (میکروگرم/سانتی‌متر مربع)) بدست آید.
کنترل منفی: حلال ماده آزمون (بدون ماده) تحت شرایط کاملاً مشابه آماده می‌شود.
کنترل مثبت (برای اعتبارسنجی روش هر 6 ماه یکبار): ماده کنترل مثبت استاندارد مانند هگزیل سینامالدئید (HCA) در غلظت 25 درصد در استون/روغن زیتون (4:1) یا DNCB (دینیتروکلروبنزن) 0/25 درصد.

روش کار

گام 1: انتخاب و قرنطینه حیوانات

حداقل 20 موش ماده CBA/J یا BALB/c، سن 8 تا 12 هفته، وزن 20 تا 30 گرم انتخاب می‌شوند. موش‌ها به مدت حداقل 5 روز در قرنطینه نگهداری شده و از نظر سلامت عمومی بررسی می‌شوند. گوش موش‌ها باید کاملاً سالم و بدون هرگونه زخم یا تحریک باشد.

گام 2: تخصیص تصادفی

موش‌ها به صورت تصادفی به 5 گروه (حداقل 4 موش در هر گروه) تقسیم می‌شوند:

گروه 1: کنترل منفی (حلال ماده آزمون)
گروه 2: غلظت پایین ماده آزمون (Low dose)
گروه 3: غلظت متوسط ماده آزمون (Mid dose)
گروه 4: غلظت بالا ماده آزمون (High dose)
گروه 5 (اختیاری): کنترل مثبت (برای اعتبارسنجی – فقط هر 6 ماه یکبار)

گام 3: فاز القا (روزهای 1، 2، 3)

در روزهای 1، 2 و 3، پشت هر دو گوش موش با دقت تراشیده می‌شود (در صورت نیاز). 25 میکرولیتر از ماده آزمون (در غلظت مربوطه) با استفاده از پیپت اتوماتیک بر روی پشت هر دو گوش (مجموعاً 50 میکرولیتر در روز) اعمال می‌شود. ماده باید به طور یکنواخت پخش شود (بدون ریختن به خارج از ناحیه گوش).

برای گروه کنترل منفی، 25 میکرولیتر حلال بر روی پشت هر دو گوش اعمال می‌شود.

برای کنترل مثبت، 25 میکرولیتر HCA 25 درصد بر روی پشت هر دو گوش اعمال می‌شود.

گام 4: ارزیابی تکثیر لنفوسیت‌ها (روز 4 یا 5)

روش TG 429 (رادیواکتیو):

در روز 4 (24 ساعت پس از آخرین تیمار)، 20 میکرولیتر تیمیدین نشاندار با تریتیوم (2 میکروکوری در 0/2 میلی‌لیتر PBS) به صورت داخل صفاقی (IP) به هر موش تزریق می‌شود. 5 ساعت بعد، موش با CO2 به روش انسانی کشته می‌شود. غدد لنفاوی گردنی (زیر فک پایین) دو طرف تشریح و خارج می‌شوند. غدد لنفاوی در PBS سرد (2 میلی‌لیتر) قرار داده شده و سوسپانسیون سلولی تهیه می‌شود. پس از شستشو، رسوب سلولی در TCA 10درصد حل شده و رادیواکتیویته با شمارنده سوسوزنی اندازه‌گیری می‌شود.

روش TG 442A (DA – اندازه گیری ATP):

در روز 4، موش با CO2 به روش انسانی کشته می‌شود. غدد لنفاوی گردنی دو طرف تشریح و خارج می‌شوند. غدد لنفاوی در بافر مخصوص (حداقل 0/5 میلی‌لیتر) قرار داده شده و هموژنایز می‌شوند. پس از سانتریفیوژ، مقدار ATP در سوپرناتانت با استفاده از کیت ATP bioluminescence (لوسفرین-لوسیفراز) و لومینومتر اندازه‌گیری می‌شود.

روش TG 442B (BrdU-ELISA):

در روز 4، 0/5 میلی‌لیتر BrdU (5-برومو-2-دئوکسی اوریدین) در PBS (غلظت 5 میلی‌گرم/میلی‌لیتر) به صورت داخل صفاقی (IP) به هر موش تزریق می‌شود. 24 ساعت بعد (روز 5)، موش با CO2 به روش انسانی کشته می‌شود. غدد لنفاوی گردنی دو طرف تشریح و خارج می‌شوند. غدد لنفاوی در PBS قرار داده شده، هموژنایز شده و میزان جذب BrdU با استفاده از کیت ELISA مخصوص BrdU و ELISA Reader در طول موج 450 نانومتر اندازه‌گیری می‌شود.

گام 5: محاسبه شاخص تحریک (Stimulation Index – SI)

برای هر حیوان، میزان تکثیر لنفوسیت‌ها (CPM برای روش رادیواکتیو، Luminescence برای DA، Absorbance برای BrdU-ELISA) ثبت می‌شود. میانگین هر گروه محاسبه می‌شود.

SI = (میانگین تکثیر گروه ماده آزمون) تقسیم بر (میانگین تکثیر گروه کنترل منفی)

اگر در حداقل یک غلظت، SI برابر یا بیشتر از مقدار بحرانی باشد، ماده حساسیت‌زا محسوب می‌شود. اگر در همه غلظت‌ها SI کمتر از مقدار بحرانی باشد، ماده فاقد حساسیت‌زایی محسوب می‌شود.

مقادیر بحرانی: روش TG 429: SI ≥ 3، روش TG 442A (DA): SI ≥ 1/8، روش TG 442B (BrdU-ELISA): SI ≥ 1/6.

گام 6: محاسبه EC3 (Effective Concentration for SI=3) یا EC1/6 (برای BrdU-ELISA)

برای مواد حساسیت‌زا، EC3 (غلظتی از ماده که باعث SI=3 می‌شود) با استفاده از درون‌یابی خطی بین غلظت‌های مجاور محاسبه می‌شود. EC3 پایین‌تر نشان‌دهنده حساسیت‌زایی قوی‌تر است.

برای روش TG 442B (BrdU-ELISA)، EC1/6 (غلظتی از ماده که باعث SI=1/6 می‌شود) محاسبه می‌شود.

معیار پذیرش

تشخیص اولیه:

معیار	نتیجه
SI در حداقل یک غلظت ≥ مقدار بحرانی	حساسیت‌زا (Positive)
SI در همه غلظت‌ها < مقدار بحرانی	فاقد حساسیت‌زایی (Negative)

مقادیر بحرانی براساس روش:

روش TG 429 رادیواکتیو: SI بزرگتر یا مساوی 3
روش TG 442A روش DA: SI بزرگتر یا مساوی 1/8
روش TG 442B روش BrdU-ELISA: SI بزرگتر یا مساوی 1/6

منطقه مرزی Borderline:

روش DA و BrdU-ELISA دارای منطقه مرزی هستند. برای DA، SI بین 1/8 تا 2/7 مرزی محسوب می‌شود که نیاز به تکرار یا روش تکمیلی دارد

طبقه‌بندی قدرت حساسیت‌زایی براساس EC3 روش TG 429:

EC3 کمتر یا مساوی 0/1 درصد: حساسیت‌زای فوق العاده قوی Category 1A
EC3 بین 0/1 تا 1 درصد: حساسیت‌زای قوی Category 1A
EC3 بین 1 تا 10 درصد: حساسیت‌زای متوسط Category 1B
EC3 بین 10 تا 100 درصد: حساسیت‌زای ضعیف Category 1B
EC3 بیشتر از 100 درصد: غیرحساسیت‌زا

طبقه‌بندی براساس EC1/6 برای روش TG 442B:

EC1/6 کمتر از 6 درصد: Category 1A حساسیت‌زای قوی تا بسیار قوی
EC1/6 بزرگتر یا مساوی 6 درصد: Category 1B حساسیت‌زای متوسط تا ضعیف

توجه: روش‌های LLNA فقط برای تشخیص حساسیت‌زا یا غیر حساسیت‌زا تأیید شده‌اند و طبقه‌بندی براساس EC3 یا EC1/6 در حال اعتبارسنجی است. با این حال، بسیاری از آژانس‌های قانونی استفاده از این معیارها را می‌پذیرند

جایگاه در فرآیند ارزیابی ایمنی

پیش‌بینی رفتار بیولوژیکی در بدن:

روش LLNA حساسیت پیش‌بینی حدود 85 تا 90 درصد برای پتانسیل حساسیت‌زایی در انسان ارائه می‌دهد. این روش فاز القا را اندازه‌گیری می‌کند اما فاز التهابی نهایی را ارزیابی نمی‌کند

EC3 بزرگتر یا مساوی 10 درصد حساسیت‌زای ضعیف: پس از تماس مکرر و طولانی ممکن است در حدود 0/1 تا 1 درصد جمعیت باعث درماتیت تماسی خفیف شود. مجاز با درج هشدار
EC3 بین 1 تا 10 درصد حساسیت‌زای متوسط: در حدود 1 تا 5 درصد افراد سالم ممکن است پس از چند هفته تا چند ماه تماس باعث اگزما و خارش شود
EC3 بین 0/1 تا 1 درصد حساسیت‌زای قوی: در بیش از 5 درصد افراد باعث حساسیت شدید و سریع می‌شود. برای تماس با پوست مناسب نیست
EC3 کمتر یا مساوی 0/1 درصد حساسیت‌زای فوق العاده قوی: باعث حساسیت در اکثر افراد بیش از 50 درصد می‌شود. مجوز پروانه ساخت دریافت نمی‌کند

مقایسه با GPMT و Buehler: LLNA پیش‌بینی محافظه‌کارانه‌تری نسبت به GPMT دارد. برای آلرژن‌های بسیار ضعیف، LLNA ممکن است منفی کاذب دهد. برای محصولات پرخطر، ترکیب LLNA با روش‌های تکمیلی توصیه می‌شود

الزامات قانونی سازمان غذا و دارو:

انجام آزمون حساسیت‌زایی برای تجهیزات با تماس طولانی یا مکرر با پوست، محصولات آرایشی بهداشتی و مواد شیمیایی الزامی است

ارجحیت روش LLNA نسبت به GPMT و Buehler:

کاهش مصرف حیوانات 20 موش در مقابل 40 تا 50 خوکچه هندی، کاهش درد و رنج حیوانات بدون استفاده از FCA، دوره کوتاه 5 تا 7 روز، نتایج کمی و عینی، قابلیت محاسبه EC3

سازمان غذا و دارو برای ایمپلنت‌ها روش GPMT را ترجیح می‌دهد و LLNA را برای تجهیزات با خطر متوسط تا کم می‌پذیرد. برای نتایج مرزی یا منفی مشکوک، انجام GPMT یا تست پچ انسانی الزامی است

توجه برای صادرات به اتحادیه اروپا: تحت قوانین آرایشی اروپا، استفاده از LLNA برای محصولات آرایشی جدید مجاز نیست. برای تجهیزات پزشکی صادراتی به اروپا، LLNA همچنان معتبر است

تفاوت با سایر آزمون‌ها

تفاوت روش LLNA با Buehler و GPMT:

LLNA: از موش استفاده می‌کند، تکثیر لنفوسیت‌ها را به صورت کمی اندازه‌گیری می‌کند، سریع‌تر با 5 تا 7 روز، کمهزینه‌تر، رفاه بالاتر حیوانات، اختصاصی‌تر با مثبت کاذب کمتر، اما حساسیت کمتر برای تشخیص آلرژن‌های بسیار ضعیف

GPMT و Buehler: از خوکچه هندی استفاده می‌کنند، نمره‌دهی ذهنی واکنش پوستی دارند، زمان 35 تا 42 روز، هزینه بالاتر، رفاه پایین‌تر حیوانات به دلیل استفاده از ادجوانت FCA و تحریک‌کننده SDS

محتوای گزارش آزمون

گزارش نهایی فقط به زبان انگلیسی شامل موارد زیر است:

عنوان کامل آزمون Local Lymph Node Assay و استاندارد مرجع ISO 10993-10 و OECD TG 429 یا TG 442A یا TG 442B براساس روش انجام شده
شناسه یکتای گزارش و تاریخ صدور
اطلاعات کامل متقاضی شامل نام شرکت، آدرس، شماره ثبت، کد اقتصادی
شرح کامل ماده آزمون شامل نام تجاری، نام شیمیایی، شماره لات، تاریخ تولید، تاریخ انقضا
نوع ماده آزمون شامل مایع، جامد، نیمه جامد، عصاره
حلال ماده آزمون و غلظت‌های مورد استفاده حداقل 3 غلظت غیرمحرک
pH ماده مایع یا عصاره آبی و در صورت pH کمتر از 2/5 یا بیشتر از 11/5 قید رقت یا خنثی‌سازی انجام شده
مشخصات کامل سیستم آزمون شامل گونه، نژاد، تعداد، وزن، سن، جنسیت، منبع تهیه، شماره شناسایی هر حیوان
شرایط نگهداری حیوانات شامل دمای 22 تا 24 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 40 تا 60 درصد، چرخه روشنایی 12 ساعت
جدول زمان‌بندی کامل آزمون شامل روزهای 1، 2، 3 القا و روز 4 یا 5 ارزیابی
داده‌های خام تکثیر لنفوسیت‌ها برای هر حیوان شامل CPM برای روش رادیواکتیو، Luminescence برای روش DA، Absorbance برای روش BrdU-ELISA
میانگین تکثیر هر گروه و انحراف معیار
شاخص تحریک برای هر غلظت ماده آزمون محاسبه شده
مقایسه SI با مقدار بحرانی شامل TG 429: SI بزرگتر یا مساوی 3، TG 442A: SI بزرگتر یا مساوی 1/8، TG 442B: SI بزرگتر یا مساوی 1/6
در صورت مثبت بودن، محاسبه EC3 یا EC1/6
طبقه‌بندی نهایی ماده شامل فاقد حساسیت‌زایی، ضعیف، متوسط، قوی، بسیار قوی، فوق العاده قوی
در صورت استفاده از کنترل مثبت، نتیجه کنترل مثبت و تایید اعتبار روش
عکس‌های رنگی از گوش موش‌ها در صورت وجود تحریک یا واکنش اختیاری
امضای مسئول فنی آزمایشگاه با تخصص ایمونولوژی یا سم‌شناسی
امضای مدیر کیفیت
مهر آزمایشگاه و گواهی تایید تحت نظارت ISO 17025

سوالات متداول فنی و حقوقی

آیا روش LLNA برای همه تجهیزات پزشکی قابل استفاده است؟

خیر، روش LLNA برای تجهیزات با تماس پوستی متوسط تا کم خطر مانند دستکش، چسب، پوشک و محصولات آرایشی قابل استفاده است. برای ایمپلنت‌های قابل کاشت و تجهیزات با تماس طولانی مدت با بافت عمقی، سازمان غذا و دارو روش GPMT را الزامی می‌داند

آیا نتایج تست حساسیت‌ زایی گره لنفاوی موضعی موش برای صادرات به اتحادیه اروپا معتبر است؟

برای تجهیزات پزشکی صادراتی به اتحادیه اروپا، بله، گزارش ISO 10993-10 و OECD TG 429/442A/442B مورد پذیرش است. برای محصولات آرایشی تحت قوانین اتحادیه اروپا، روش‌های حیوانی از جمله LLNA ممنوع است

چه مقدار نمونه برای انجام تست حساسیت‌ زایی LLNA نیاز است؟

مواد مایع: حداقل 5 میلی‌لیتر، با احتساب خطا 10 میلی‌لیتر توصیه می‌شود

مواد جامد: حداقل 3 گرم، با احتساب خطا 5 گرم توصیه می‌شود

تجهیزات: حداقل 50 سانتی‌متر مربع برای تهیه عصاره. ارسال 20 درصد نمونه اضافی توصیه می‌شود

مدت اعتبار گواهی LLNA چقدر است؟

تا 5 سال معتبر است. تغییر در فرمولاسیون، فرآیند تولید، بسته‌بندی یا بروز شکایت بالینی نیاز به تکرار آزمون دارد

آیا می‌توان از عصاره ماده در تست حساسیت‌ زایی گره لنفاوی موضعی موش استفاده کرد؟

بله، برای تجهیزات بزرگ که نمی‌توان ماده مستقیم را به گوش موش اعمال کرد، عصاره ماده براساس ISO 10993-12 تهیه می‌شود. شرایط عصاره‌گیری: دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 72 ساعت در نرمال سالین یا روغن گیاهی

چه عواملی باعث منفی کاذب در روش LLNA می‌شوند؟

غلظت ناکافی ماده آزمون، حلال نامناسب، آلرژن‌های پروهاپتن نیاز به فعال شدن متابولیکی، مواد با وزن مولکولی بسیار بالا. آزمایشگاه سنجش ساناژن از غلظت حداکثر غیرتحریک‌کننده و حلال استاندارد استفاده می‌کند

آیا تست حساسیت‌ زایی گره لنفاوی موضعی موش برای فلزات قابل استفاده است؟

بله، اما با احتیاط. فلزات ممکن است در LLNA منفی کاذب بدهند. برای فلزات، روش GPMT همچنان استاندارد طلایی محسوب می‌شود

تفاوت بین روش‌های TG 429، TG 442A و TG 442B در LLNA چیست؟

TG 429 رادیواکتیو: استاندارد طلایی، دقت بالا اما نیاز به مجوز مواد رادیواکتیو

TG 442A روش DA: اندازه‌گیری ATP با بیولومینسانس، بدون رادیواکتیو، منطقه مرزی SI 1/8 تا 2/7

TG 442B روش BrdU-ELISA: اندازه‌گیری BrdU با ELISA، بدون رادیواکتیو، تکنیک رایج در آزمایشگاه‌ها

آزمایشگاه سنجش ساناژن روش پیش‌فرض TG 442B می‌باشد

آیا می‌توان از موش‌های نر به جای ماده در تست حساسیت‌ زایی گره لنفاوی موضعی موش استفاده کرد؟

استاندارد استفاده از موش ماده را توصیه می‌کند. آزمایشگاه سنجش ساناژن مطابق با استاندارد از موش ماده استفاده می‌کند

آیا روش LLNA برای محصولات با تماس با مخاط قابل تعمیم است؟

خیر، روش LLNA برای پوست طراحی شده است و نتایج آن به مخاط قابل تعمیم نیست. برای محصولات با تماس مخاطی، انجام آزمون حساسیت‌زایی مخاطی جداگانه الزامی است

آیا آزمایشگاه سنجش ساناژن مشاوره اعتراض ارائه می‌دهد؟

بله، واحد حقوقی و پشتیبانی فنی آماده ارائه مشاوره، تنظیم نامه اعتراض و حضور در جلسات کمیته می‌باشد. در صورت اثبات خطای آزمایشگاهی، گزارش اصلاحی رایگان صادر می‌شود

تماس با واحد پشتیبانی

برای مشاوره رایگان و هماهنگی ارسال نمونه، با کارشناسان ما تماس بگیرید.

📱 پیام‌رسان بله: 989900100182+

📞 تماس تلفنی: 982191010809+

✉️ پیامک: 989900100182+

📋 مدارک

⚠️ تکمیل و ارسال کلیه مدارک و فرم‌های مورد نیاز پیش از ارسال نمونه به آزمایشگاه الزامی است. لطفاً مدارک را به‌صورت کامل و صحیح ارسال نمایید. در صورت وجود نقص یا مغایرت در اطلاعات، فرآیند پذیرش نمونه، بررسی فنی و شروع آزمون با تأخیر مواجه خواهد شد.

مدارک مورد نیاز قبل از ارسال نمونه به آزمایشگاه

🚚 ارسال نمونه

⚠️ پیش از ارسال نمونه، لطفاً الزامات و شرایط حمل، نگهداری و بسته‌بندی نمونه را به دقت مطالعه نموده و جهت اطمینان از پذیرش صحیح نمونه، با واحد پذیرش آزمایشگاه هماهنگی لازم را انجام دهید.

شرایط ارسال نمونه به آزمایشگاه

💰 هزینه آزمون

⚠️ جهت دریافت هزینه دقیق و به‌روز آزمون‌ها، لطفاً فرم درخواست آزمون را از طریق پیام‌رسان بله یا ایمیل برای آزمایشگاه ارسال نمایید. درخواست شما توسط کارشناسان فنی بررسی شده و هزینه نهایی بر اساس نوع آزمون، تعداد نمونه‌ها و الزامات مطالعه اعلام خواهد شد.

استعلام هزینه آزمون

📊 گزارش آزمون

⚠️ گزارش نهایی آزمون پس از تکمیل تمامی مراحل آزمایش، بررسی نتایج و تأیید واحد کنترل کیفیت، در کوتاه‌ترین زمان ممکن صادر شده و حداکثر ظرف 10 روز کاری در قالب گزارش رسمی انگلیسی به متقاضی تحویل خواهد شد.

گزارش نهایی آزمون

حساسیت‌ زایی – گره لنفاوی موش (LLNA)