آزمون تحریک‌ زایی پوستی RhE 

 

الزام دریافت تأییدیه برای تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی و دارویی

خلاصه آزمون

زمینه و هدف: آزمون تحریکزایی پوستی RhE یکی از روش‌های پیشرفته و جایگزین حیوانی برای ارزیابی تحریک پذیری پوستی مواد و تجهیزات پزشکی است که بر پایه مدل اپیدرم بازسازی‌شده انسانی انجام می‌شود. این روش با استفاده از بافت سه‌بعدی مشابه پوست انسان، امکان بررسی مستقیم اثر مواد بر سلول‌های اپیدرمی را فراهم می‌کند. با توجه به توسعه روش‌های جایگزین و کاهش استفاده از حیوانات آزمایشگاهی، مدل RhE به عنوان یک ابزار معتبر برای ارزیابی ایمنی زیستی محصولات پزشکی، مواد اولیه، ترکیبات شیمیایی و فرآورده‌های سلامت‌محور مورد توجه قرار گرفته است. استاندارد ISO 10993-23 استفاده از روش‌های جایگزین معتبر را برای ارزیابی تحریک‌زایی توصیه می‌کند. هدف از آزمون تحریک‌زایی پوستی RhE تعیین توانایی یک ماده در ایجاد آسیب سلولی و واکنش تحریکی در اپیدرم انسانی بازسازی‌شده و پیش‌بینی خطر تحریک پوستی در شرایط مصرف انسانی است.

روش انجام: در تست تحریکزایی پوستی RhE از مدل‌های تجاری اپیدرم بازسازی‌شده انسانی که دارای ساختار چندلایه مشابه پوست طبیعی انسان هستند استفاده می‌شود. ابتدا بافت‌های RhE در شرایط کنترل‌شده کشت و آماده‌سازی می‌شوند. سپس مقدار مشخصی از نمونه مورد آزمون به صورت مستقیم روی سطح اپیدرم اعمال می‌گردد. در کنار گروه آزمون، کنترل منفی و کنترل مثبت نیز برای اعتبارسنجی نتایج مورد استفاده قرار می‌گیرند. پس از پایان دوره تماس تعیین‌شده، نمونه‌ها شستشو داده شده و برای ارزیابی زنده‌مانی سلولی مورد بررسی قرار می‌گیرند. سنجش زنده‌مانی معمولاً با استفاده از آزمون MTT انجام می‌شود که فعالیت متابولیکی سلول‌های زنده را اندازه‌گیری می‌کند. میزان جذب نوری حاصل از تشکیل فورمازان در بافت‌های تیمار شده اندازه‌گیری شده و درصد زنده‌مانی سلولی نسبت به کنترل منفی محاسبه می‌گردد. علاوه بر این، در برخی مطالعات ارزیابی‌های هیستولوژیک و بررسی نشانگرهای التهابی نیز به عنوان اطلاعات تکمیلی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

یافته‌ها و طبقه‌بندی: نتایج تست تحریکزایی پوستی RhE نشان می‌دهد که مواد غیرمحرک معمولاً تأثیر قابل توجهی بر زنده‌مانی سلول‌های اپیدرمی ندارند و ساختار بافتی اپیدرم حفظ می‌شود. در مقابل، مواد محرک موجب آسیب سلولی، کاهش فعالیت متابولیکی و افت زنده‌مانی سلولی می‌شوند. هرچه شدت آسیب بیشتر باشد، میزان کاهش زنده‌مانی نیز افزایش می‌یابد. بر اساس معیارهای پذیرفته‌شده در روش RhE، اگر زنده‌مانی سلولی پس از تماس با نمونه بیشتر از50% مقدار کنترل منفی باشد، ماده معمولاً به عنوان غیرمحرک طبقه‌بندی می‌شود. در مقابل، زنده‌مانی مساوی یا کمتر از50% می‌تواند نشان‌دهنده وجود خاصیت تحریک‌کنندگی باشد. این رویکرد امکان تفکیک مواد محرک از مواد غیرمحرک را با دقت مناسب و قابلیت تکرارپذیری بالا فراهم می‌کند. نتایج حاصل ارتباط مناسبی با پاسخ‌های مشاهده‌شده در پوست انسان داشته و برای ارزیابی ریسک بیولوژیکی محصولات بسیار ارزشمند هستند.

نتیجه‌گیری: آزمون تحریکزایی پوستی RhE مطابق اصول ISO 10993-23 یک روش علمی، استاندارد و مبتنی بر مدل انسانی برای ارزیابی تحریک‌پذیری پوستی محسوب می‌شود. این آزمون با استفاده از اپیدرم بازسازی‌شده انسانی و اندازه‌گیری زنده‌مانی سلولی، امکان شناسایی مواد دارای پتانسیل تحریک‌کنندگی را بدون نیاز به استفاده گسترده از حیوانات آزمایشگاهی فراهم می‌کند. نتایج حاصل نقش مهمی در ارزیابی زیست‌سازگاری، مدیریت ریسک، کنترل کیفیت، توسعه محصولات ایمن‌تر و اخذ تأییدیه‌های قانونی ایفا می‌کنند. به دلیل شباهت ساختاری بالا به پوست انسان، این روش یکی از معتبرترین ابزارهای جایگزین برای ارزیابی تحریک‌زایی پوستی در صنایع پزشکی، دارویی و بهداشتی محسوب می‌شود.

واژگان کلیدی: تحریکزایی پوستی، RhE، ISO 10993-23، اپیدرم بازسازی‌شده انسانی، زیست‌سازگاری، زنده‌مانی سلولی، MTT، ارزیابی ایمنی زیستی، تحریک پوستی، مدل جایگزین حیوانی، کنترل کیفیت، مدیریت ریسک

تصویر خلاصه آزمون

خلاصه-تست تحریک-زایی-پوستی-rhe

⚠️ الزامات قانونی

انجام آزمون تحریک‌پذیری پوستی برای تمامی محصولات آرایشی و بهداشتی قابل استفاده روی پوست و تجهیزات پزشکی با تماس سطحی با پوست الزامی است. این الزام بر اساس آیین‌نامه اتحادیه اروپا و استاندارد ISO 10993-23 می‌باشد. روش مدل اپیدرم انسانی بازسازیشده (RhE) یک روش معتبر و تأیید شده توسط مرجع اروپایی جایگزین‌های آزمون حیوانی است و به عنوان جایگزین کامل آزمون حیوانی پذیرفته شده است. این روش برای طبقه‌بندی و برچسب‌گذاری مواد بر اساس سیستم هماهنگ جهانی استفاده شده و مواد را در دو دسته تحریک‌کننده (رده 2) یا غیرتحریک‌کننده (بدون رده) قرار می‌دهد.

تست تحریک‌زایی پوستی RhE

در آزمون تحریک‌ زایی پوستی RhE، نمونه محصول روی مدل اپیدرم انسانی بازسازیشده (RhE) که از سلول‌های کراتینوسیت انسان ساخته شده، اعمال می‌گردد. پس از مدت تماس مشخص و سپس یک دوره انکوباسیون، درصد زنده ماندن سلول‌ها (قوه حیات) با استفاده از روش رنگ‌سنجی MTT اندازه‌گیری می‌شود. اگر قوه حیات پنجاه درصد یا کمتر باشد، ماده تحریک‌کننده و اگر بیشتر از پنجاه درصد باشد، غیرتحریک‌کننده (ایمن برای پوست) طبقه‌بندی می‌گردد. این روش مطابق با استانداردهای OECD 439 و ISO 10993-23 انجام شده و به عنوان جایگزین معتبر آزمون حیوانی شناخته می‌شود.

OECD 439: این استاندارد مرجع اصلی سازمان همکاری و توسعه اقتصادی برای آزمون تحریک‌پذیری پوستی درون‌شیشه‌ای با استفاده از مدل اپیدرم انسانی بازسازی شده می‌باشد. 

ISO 10993-23: این استاندارد مرجع آزمون‌های تحریک‌پذیری و حساسیت‌زایی برای تجهیزات پزشکی می‌باشد و استفاده از روش‌های جایگزین درون‌شیشه‌ای مانند مدل اپیدرم انسانی بازسازی شده را به عنوان بخشی از استراتژی ارزیابی تجهیزات پزشکی پذیرفته است.

EURL ECVAM Performance Standards: این استانداردهای عملکردی مرجع اروپایی برای اعتبارسنجی روش‌های جایگزین می‌باشد که معیارهای دقت، تکرارپذیری و صحت روش‌های مختلف مدل اپیدرم انسانی بازسازی شده را تعیین می‌کند.

مواردی که آزمون تحریک‌ زایی پوستی RhE الزامی است:

  • تمامی محصولات آرایشی و بهداشتی شامل کرم‌ها، لوسیون‌ها، شامپوها، صابون‌ها، ژل‌های دوش، محصولات مراقبت از پوست و محصولات آرایشی
  • مواد شیمیایی و شوینده‌های صنعتی که با پوست تماس دارند
  • تجهیزات پزشکی با تماس سطحی با پوست شامل چسب‌های پزشکی، پچ‌ها، بانداژها، دستکش‌های جراحی و پروب‌های اولتراسوند
  • داروهای موضعی شامل پمادها، کرم‌ها و ژل‌ها
  • نانومواد مانند نانوذرات دی اکسید تیتانیوم در ضدآفتاب‌ها
  • عصاره‌های تجهیزات پزشکی به روش اصلاح شده

مواردی که آزمون تحریک‌ زایی پوستی RhE الزامی نیست:

  • تجهیزاتی که هیچ تماسی با پوست ندارند
  • محصولات خوراکی که بلعیده می‌شوند و با پوست تماس ندارند
  • تجهیزات پزشکی کاشته شونده که نیاز به آزمون‌های دیگر مانند ایمپلنت دارند

تحریک‌پذیری پوستی: یک واکنش التهابی برگشت‌پذیر پوست در اثر تماس با یک ماده است که معمولاً با قرمزی و تورم مشخص می‌شود.

مدل اپیدرم انسانی بازسازی شده (RhE): یک مدل سه بعدی از اپیدرم انسان است که از کراتینوسیت‌های انسانی در شرایط آزمایشگاهی ساخته می‌شود. این مدل از نظر بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی شباهت زیادی به اپیدرم بالایی پوست انسان دارد و شامل کراتینوسیت‌های زنده چندلایه با عملکرد سد قوی می‌باشد.

زنده مانی سلولی: درصد سلول‌های زنده در بافت پس از تماس با ماده آزمون می‌باشد. این پارامتر با استفاده از روش MTT اندازه‌گیری می‌شود.

روش MTT: یک روش رنگ‌سنجی برای اندازه‌گیری قوه حیات سلولی می‌باشد. آنزیم میتوکندری سلول‌های زنده، MTT زرد رنگ را به کریستال‌های فرمازان آبی-بنفش تبدیل می‌کند که پس از عصاره‌گیری با اسپکتروفتومتر در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری می‌شود.

حد آستانه تحریک‌پذیری (Cut-off) سطحی از قوه حیات سلولی است که برای تمایز مواد تحریک‌کننده از غیرتحریک‌کننده استفاده می‌شود. بر اساس OECD 439، قوه حیات 50 درصد یا کمتر نشانه تحریک‌کننده و قوه حیات بیشتر از 50 درصد نشانه غیرتحریک‌کننده می‌باشد.

  • استاندارد مرجع: OECD 439 و ISO 10993-23
  • مدل آزمایشگاه: SkinEthic RHE
  • حجم نمونه مایع: 25 تا 40 میکرولیتر
  • مقدار نمونه جامد: 10 تا 25 میلی‌گرم
  • زمان تماس: 42 دقیقه
  • زمان انکوباسیون: 42 ساعت
  • روش اندازه‌گیری: MTT در طول موج 570 نانومتر
  • کنترل مثبت: سدیم دودسیل سولفات 5 درصد
  • کنترل منفی: محلول بافر فسفات
  • تعداد تکرار: 3 بافت
  • معیار پذیرش: کنترل مثبت زیر 50 درصد، کنترل منفی بالای 90 درصد
  • طبقه‌بندی: رده 2 تحریک‌کننده یا بدون رده غیرتحریک‌کننده
  • زمان انجام: 5 تا 7 روز کاری

مدل RhE: شامل کراتینوسیت‌های انسانی با ساختار چندلایه مشابه اپیدرم انسان.

تماس موضعی: اعمال ماده (مایع، جامد یا نیمه‌جامد) روی سطح مدل برای مدت مشخص (معمولاً 42 دقیقه).

پس‌انکوباسیون: 42 ساعت در شرایط استاندارد (دمای 37 درجه سانتی‌گراد، 5 درصد CO2).

سنجش قوه حیات: با روش MTT که فعالیت آنزیم میتوکندری سلول‌های زنده را اندازه می‌گیرد.

طبقه‌بندی: اگر قوه حیات 50 درصد یا کمتر نسبت به کنترل منفی باشد، ماده تحریک‌کننده (رده 2 GHS) و اگر بیشتر از 50 درصد باشد، غیرتحریک‌کننده است.

تجهیزات اصلی: انکوباتور CO2 (37 درجه، 5 درصد CO2)، هود لامینار کلاس 2، الایزا خوان (570 نانومتر)، پیپت چند کاناله، پلیت 24/96 خانه، ورتکس، سانتریفیوژ، فریزر 20- درجه، میکروسکوپ، pH متر.

مواد مصرفی: مدل RhE، محیط کشت اختصاصی، بافر فسفات، محلول MTT، ایزوپروپانول، کنترل مثبت، کنترل منفی، لوله فالکون، دستکش استریل، الکل 70 درصد.

مایعات آرایشی و بهداشتی: نمونه رقیق نشده، حجم متناسب با مدل.

جامدات آرایشی و بهداشتی: مقدار مشخصی پودر یا خمیر به همراه مقدار کمی آب یا بافر برای خیس شدن.

عصاره تجهیزات پزشکی: بر اساس نسبت سطح به حجم استاندارد، به صورت رقیق نشده.

مواد شیمیایی: با غلظت خالص یا حداکثر غلظت مصرف.

آماده‌سازی اولیه: بافت‌های مدل پوست انسانی بازسازیشده از یخچال خارج شده و در محیط کشت مخصوص، به مدت یک شبانه‌روز در انکوباتور (دمای بدن، همراه با CO2) نگهداری می‌شوند.

تیمار با نمونه: پس از تعویض محیط کشت، نمونه (مایع، جامد یا عصاره) روی سطح بافت اعمال می‌گردد. کنترل مثبت و منفی نیز در نظر گرفته می‌شود. بافت حدود 42 دقیقه در انکوباتور می‌ماند.

شستشو و انکوباسیون مجدد: بافت شسته شده، محیط کشت تازه اضافه می‌شود و به مدت حدود 42 ساعت مجدداً انکوبه می‌گردد.

سنجش قوه حیات: با استفاده از روش MTT، درصد سلول‌های زنده اندازه‌گیری می‌شود.

طبقه‌بندی نهایی:

  • اگر قوه حیات 50 درصد یا کمتر باشد: ماده تحریک‌کننده است.

  • اگر قوه حیات بیشتر از 50 درصد باشد: ماده غیرتحریک‌کننده (ایمن برای پوست) است.

زنده مانی سلولی طبقه‌بندی دسته GHS
≤ ۵۰% تحریک‌کننده رده ۲
> ۵۰% غیرتحریک‌کننده بدون رده

شرایط اعتبار آزمون:

  • کنترل مثبت (SDS 5%) باید قوه حیات ≤ 50% نشان دهد.

  • کنترل منفی (DPBS) باید قوه حیات > 90% نشان دهد.

  • ضریب تغییرات (CV) درون هر گروه (3 بافت) باید کمتر از 20درصد باشد.

در صورت عدم تحقق این شرایط، آزمون باطل بوده و باید تکرار شود.

غربالگری اولیه تحریک‌پذیری:

این روش برای شناسایی مواد تحریک‌کننده پوست (مانند اسیدها، بازها، شوینده‌ها) با دقت بالا استفاده می‌شود. محصولاتی که در این غربالگری تحریک‌کننده شناخته شوند، نیاز به بهینه‌سازی فرمولاسیون یا برچسب‌گذاری خطر دارند.

پیش‌بینی رفتار در بدن:

مواد با قوه حیات بیشتر از 50 درصد (غیرتحریک‌کننده): در تماس با پوست انسان واکنش قابل توجهی (قرمزی و تورم) ایجاد نمی‌کنند.

مواد با قوه حیات 50 درصد یا کمتر (تحریک‌کننده): احتمالاً باعث قرمزی، تورم، خشکی و پوسته‌ریزی و در موارد شدید تاول و فرسایش سطحی می‌شوند.

الزامات قانونی سازمان غذا و دارو:

سازمان غذا و داروی ایران انجام آزمون تحریک‌پذیری پوستی را برای کلیه محصولات قابل استفاده روی پوست الزامی می‌داند. روش مدل اپیدرم انسانی بازسازیشده مطابق OECD 439 به عنوان جایگزین کامل آزمون حیوانی پذیرفته شده است. برای تجهیزات پزشکی، این آزمون بخشی از پنل زیست‌سازگاری استاندارد ISO 10993-10 است. 

تفاوت RhE با آزمون تحریک‌پذیری حیوانی (Draize – OECD 404): آزمون حیوانی روی پوست خرگوش انجام می‌شود، زمان‌بر، پرهزینه و نیازمند استفاده از حیوانات است. روش RhE سریع‌تر، ارزان‌تر، بدون استفاده از حیوانات و با همبستگی بالا با نتایج انسانی است و از سال ۲۰۱۰ به عنوان جایگزین معتبر پذیرفته شده.

تفاوت RhE با آزمون خوردگی پوستی (OECD 431): آزمون OECD 431 برای خوردگی پوستی (آسیب برگشت‌ناپذیر) و آزمون OECD 439 برای تحریک‌پذیری پوستی (واکنش برگشت‌پذیر) به کار می‌رود.

تفاوت بین مدل‌های مختلف RhE: مدل‌هایی مانند EpiDerm، SkinEthic، KeraSkin و LabCyte در جزئیاتی مثل حجم نمونه و زمان تماس تفاوت دارند، اما همگی بر اساس OECD 439 اعتبارسنجی شده و از معیار طبقه‌بندی یکسان استفاده می‌کنند.

مزیت روش RhE نسبت به روش‌های قدیمی: حذف استفاده از حیوانات، دقت و تکرارپذیری بالا، امکان انجام برای مواد رنگی، و همبستگی مستقیم با فیزیولوژی انسان.

  • نام و مشخصات محصول، ماده و درخواست‌دهنده
  • تاریخ انجام آزمون و شماره شناسایی یکتای گزارش
  • مرجع استاندارد: OECD 439 و ISO 10993-10
  • مدل RhE استفاده شده: SkinEthic RHE
  • نتایج پیش‌آزمون‌های تداخل (در صورت نیاز)
  • مقادیر جذب نوری، میانگین و انحراف معیار قوه حیات برای هر نمونه
  • درصد قوه حیات نسبت به کنترل منفی
  • طبقه‌بندی نهایی: تحریک‌کننده یا غیرتحریک‌کننده
  • اعتبار آزمون: تأیید کنترل مثبت و کنترل منفی
  • نتیجه نهایی: قابل قبول یا مردود برای تماس پوستی
  • امضا و مهر رسمی آزمایشگاه سنجش ساناژن

آیا برای تمام محصولات آرایشی و بهداشتی، آزمون RhE الزامی است؟
بله. برای تمام محصولات آرایشی و بهداشتی که روی پوست استفاده می‌شوند، انجام آزمون تحریک‌پذیری پوستی الزامی است.

اگر محصول من قوه حیات کمتر از پنجاه درصد نشان دهد، آیا مردود محسوب می‌شود؟
بله. محصول به عنوان تحریک‌کننده پوست طبقه‌بندی شده و باید روی برچسب عبارت هشدار درج شود.

آیا روش RhE برای مواد رنگی (مانند رنگ مو) قابل استفاده است؟
بله. با استفاده از پیش‌آزمون‌های تداخل مانند NSMTT، NSCliving و NSCkilled یا روش HPLC.

آیا روش RhE برای عصاره تجهیزات پزشکی قابل استفاده است؟
بله. با روش RhE اصلاح شده بر اساس استاندارد ISO 10993-12.

گزارش تست تحریکزایی پوستی RhE برای سازمان غذا و دارو و CE چند سال اعتبار دارد؟
در صورت عدم تغییر در فرمولاسیون، فرآیند تولید و بسته‌بندی، گزارش تا پنج سال اعتبار دارد.

آیا آزمایشگاه سنجش ساناژن مجاز به انجام آزمون RhE است؟
بله. دارای تاییدیه WHO، ISO 17025 و مجوز رسمی از سازمان غذا و داروی ایران می‌باشد.

هزینه و زمان انجام آزمون RhE چقدر است؟
زمان انجام حدود پنج تا هفت روز کاری. برای استعلام هزینه با واحد پشتیبانی تماس بگیرید.

آیا روش RhE می‌تواند تحریک پذیری خفیف را تشخیص دهد؟
خیر. فقط تحریک‌کننده را از غیرتحریک‌کننده جدا می‌کند.

آیا می‌توانم به جای روش RhE از آزمون حیوانی استفاده کنم؟
در اتحادیه اروپا از سال 2009 ممنوع است. سازمان غذا و داروی ایران و FDA نیز روش RhE را به عنوان جایگزین معتبر تشویق می‌کنند.

آیا نانوذرات با روش RhE قابل ارزیابی هستند؟
بله. به عنوان مثال، نانوذرات دی اکسید تیتانیوم در ضدآفتاب‌ها غیرتحریک‌کننده هستند.

برای مشاوره رایگان و هماهنگی ارسال نمونه، با کارشناسان ما تماس بگیرید.

 پیام‌رسان بله: 989900100182+

 تماس تلفنی: 982191010809+

تست تحریکزایی پوستی-rhe

تکمیل و ارسال کلیه مدارک و فرم‌های مورد نیاز پیش از ارسال نمونه به آزمایشگاه الزامی است. لطفاً مدارک را به‌صورت کامل و صحیح ارسال نمایید. در صورت وجود نقص یا مغایرت در اطلاعات، فرآیند پذیرش نمونه، بررسی فنی و شروع آزمون با تأخیر مواجه خواهد شد.

مدارک مورد نیاز قبل از ارسال نمونه به آزمایشگاه

پیش از ارسال نمونه، لطفاً الزامات و شرایط حمل، نگهداری و بسته‌بندی نمونه را به دقت مطالعه نموده و جهت اطمینان از پذیرش صحیح نمونه، با واحد پذیرش آزمایشگاه هماهنگی لازم را انجام دهید.

شرایط ارسال نمونه به آزمایشگاه

جهت دریافت هزینه دقیق و به‌روز آزمون‌ها، لطفاً فرم درخواست آزمون را از طریق پیام‌رسان بله یا ایمیل برای آزمایشگاه ارسال نمایید. درخواست شما توسط کارشناسان فنی بررسی شده و هزینه نهایی بر اساس نوع آزمون، تعداد نمونه‌ها و الزامات مطالعه اعلام خواهد شد.

استعلام هزینه آزمون

گزارش نهایی آزمون پس از تکمیل تمامی مراحل آزمایش، بررسی نتایج و تأیید واحد کنترل کیفیت، در کوتاه‌ترین زمان ممکن صادر شده و حداکثر ظرف 10 روز کاری در قالب گزارش رسمی انگلیسی به متقاضی تحویل خواهد شد.

گزارش نهایی آزمون