آزمون سمیت ژنی کومت

الزام دریافت تأییدیه برای تجهیزات پزشکی، مواد اولیه، محصولات آرایشی و دارویی

خلاصه آزمون

زمینه و هدف: آزمون کومت (Single Cell Gel Electrophoresis Assay) یکی از حساس‌ترین روش‌های ارزیابی آسیب DNA در سطح تک‌سلولی است که در مطالعات سمیت ژنی و ارزیابی زیست‌سازگاری مواد پزشکی بر اساس الزامات ISO 10993-3 مورد استفاده قرار می‌گیرد. این آزمون توانایی شناسایی طیف وسیعی از آسیب‌های ژنتیکی شامل شکست‌های تک‌رشته‌ای و دو‌رشته‌ای DNA، جایگاه‌های حساس به قلیا، آسیب‌های ناشی از استرس اکسیداتیو و فرآیندهای ناقص ترمیم DNA را دارد. هدف اصلی آزمون کومت، تعیین پتانسیل ژنوتوکسیک مواد، عصاره‌های استخراجی تجهیزات پزشکی، زیست‌مواد و فرآورده‌های دارویی از طریق ارزیابی مستقیم آسیب وارد شده به DNA سلول‌ها است. به دلیل حساسیت بالا، سرعت اجرا و نیاز به تعداد کم سلول، این روش به‌عنوان یکی از ابزارهای مهم غربالگری سمیت ژنتیکی شناخته می‌شود.

روش انجام: در تست سمیت ژنی کومت، سلول‌های پستانداران کشت‌شده یا سلول‌های جداشده از بافت‌های حیوانی پس از مواجهه با ماده آزمون، جمع‌آوری می‌شوند. سپس سلول‌ها در آگاروز با نقطه ذوب پایین معلق شده و روی لام‌های مخصوص پوشش داده می‌شوند. پس از جامد شدن آگاروز، سلول‌ها تحت تیمار لیز قرار می‌گیرند تا غشاهای سلولی و هسته‌ای حذف شده و تنها DNA باقی بماند. در ادامه، لام‌ها در محلول قلیایی قرار می‌گیرند تا رشته‌های DNA باز شده و آسیب‌های موجود آشکار شوند. سپس فرآیند الکتروفورز انجام می‌شود. در اثر میدان الکتریکی، قطعات آسیب‌دیده DNA از هسته خارج شده و الگویی شبیه دنباله‌دار ایجاد می‌کنند که به دلیل شباهت ظاهری به دنباله‌دار، «کومت» نامیده می‌شود. پس از رنگ‌آمیزی با رنگ‌های فلورسنت مناسب مانند Ethidium Bromide یا SYBR Green، نمونه‌ها با میکروسکوپ فلورسنت بررسی می‌شوند. پارامترهایی نظیر طول دنباله، درصد DNA موجود در دنباله و شاخص Tail Moment به‌صورت کمی اندازه‌گیری می‌شوند.

یافته‌ها و طبقه‌بندی: نتایج تست سمیت ژنی کومت بر اساس میزان مهاجرت DNA از هسته سلول تفسیر می‌شوند. سلول‌های سالم دارای هسته‌ای فشرده و بدون دنباله هستند، در حالی که سلول‌های آسیب‌دیده الگوی مشخصی از سر و دنباله را نشان می‌دهند. با افزایش شدت آسیب DNA، طول دنباله و درصد DNA موجود در دنباله افزایش می‌یابد. یافته‌ها معمولاً به‌صورت مقایسه با کنترل منفی و کنترل مثبت گزارش می‌شوند. در بسیاری از مطالعات، سلول‌ها بر اساس شدت آسیب در پنج کلاس از صفر تا چهار طبقه‌بندی می‌شوند؛ به‌طوری‌که کلاس صفر نشان‌دهنده عدم آسیب و کلاس چهار بیانگر آسیب شدید DNA است. افزایش معنی‌دار شاخص‌های کومت نسبت به کنترل منفی نشان‌دهنده وجود اثر ژنوتوکسیک ماده آزمون خواهد بود.

نتیجه‌گیری: آزمون کومت یکی از دقیق‌ترین و حساس‌ترین روش‌های ارزیابی سمیت ژنی محسوب می‌شود که قابلیت شناسایی آسیب‌های اولیه DNA را پیش از بروز جهش‌های پایدار فراهم می‌کند. این آزمون به دلیل سرعت بالا، نیاز به تعداد کم سلول، قابلیت کاربرد در شرایط آزمایشگاهی و درون‌تنی و حساسیت زیاد نسبت به آسیب‌های ژنتیکی، جایگاه ویژه‌ای در ارزیابی زیست‌سازگاری تجهیزات پزشکی و مواد زیستی دارد. اجرای این مطالعه مطابق الزامات ISO 10993-3 اطلاعات ارزشمندی در خصوص پتانسیل ژنوتوکسیک مواد فراهم کرده و نقش مهمی در ارزیابی ریسک بیولوژیکی و تضمین ایمنی محصولات پزشکی ایفا می‌کند.

واژگان کلیدی: سمیت ژنی، آزمون کومت، Comet Assay، ISO 10993-3، آسیب DNA، ژنوتوکسیسیته، الکتروفورز ژل تک‌سلولی، Tail Moment، ارزیابی زیست‌سازگاری، تجهیزات پزشکی، شکست رشته DNA.

آزمون های مشابه

تصویر خلاصه آزمون

تست-سمیت-ژنی-کومت

⚠️ الزامات قانونی

انجام آزمون کومت برای اخذ پروانه ساخت، کد آی آر سی و تاییدیه سازمان غذا و دارو جهت ورود به بازار ایران و بازارهای بین‌المللی برای تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت (بیش از 24 ساعت) و تماس ایمپلنت (بیش از 30 روز) الزامی است. این آزمون به عنوان یکی از روش‌های معتبر برون تنی برای ارزیابی شکست DNA (تک و دو رشته‌ای) در سطح سلول منفرد معرفی شده است. نتایج آن برای اثبات عدم وجود آسیب DNA در تجهیزات پزشکی، مواد اولیه و محصولات آرایشی بهداشتی و دارویی مورد پذیرش مراجع قانونی قرار می‌گیرد.

تست کومت (SCGE)

هدف آزمون سمیت ژنی کومت (Comet Assay)، ارزیابی آسیب به DNA سلول‌ها در سطح تک سلولی می‌باشد. در این روش، سلول‌های تحت تأثیر ماده آزمون در آگاروز قالب‌گیری شده و پس از لیز و الکتروفورز، DNA آسیب‌دیده به صورت دنباله‌ای شبیه به دنباله‌دار (کومت) از هسته خارج می‌شود. طول و شدت این دنباله با میزان شکست رشته‌های DNA (تک رشته یا دو رشته) متناسب است. هدف نهایی، تشخیص پتانسیل ژنوتوکسیک تجهیزات پزشکی، نانومواد و محصولات شیمیایی (به ویژه مواردی که در آزمون ایمز نتیجه منفی دارند اما مشکوک هستند) و تعیین میزان آسیب ژنتیکی برای اخذ تأییدیه سازمان غذا و دارو می‌باشد.

OECD 489: این دستورالعمل مرجع اصلی برای انجام آزمون الکتروفورز سلول منفرد (کومت) می‌باشد. این آزمون برای تشخیص شکست DNA (تک و دو رشته‌ای) در سطح سلول منفرد با حساسیت بالا طراحی شده است. این روش قادر به شناسایی آسیب‌های DNA ناشی از عوامل کلستوژنیک (شکست کروموزومی) و آنیوژنیک (ناهنجاری دوک میتوزی) است.

ISO 10993-3: این استاندارد مرجع اصلی برای انجام آزمون‌های سمیت ژنی تجهیزات پزشکی می‌باشد و الزامات ارزیابی جهش زایی، کلستوژنیسیته و شکست DNA را مشخص می‌کند. بر اساس این استاندارد، از آنجا که هیچ آزمون واحدی قادر به شناسایی همه عوامل ژنوتوکسیک نیست، انجام یک باتری از آزمون‌ها (شامل OECD 489) الزامی است.

ISO 10993-12: این استاندارد به آماده‌سازی نمونه و عصاره گیری اختصاص دارد. نحوه برش، آماده‌سازی و عصاره گیری نمونه‌های تجهیزات پزشکی برای انجام آزمون کومت، دقیقاً مطابق با این استاندارد انجام می‌شود.

OECD 474: این دستورالعمل برای آزمون ریزهسته درون تنی می‌باشد که نسخه درون تنی آزمون کومت به شمار می‌رود و در صورت نیاز به تأیید نتایج برون تنی استفاده می‌شود.

مواد و تجهیزات نیازمند آزمون کومت:

  • تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت بیش از ۲۴ ساعت تا ۳۰ روز
  • تجهیزات پزشکی با تماس ایمپلنت (بیش از ۳۰ روز)
  • تجهیزات پزشکی ساخته شده از پلیمر، فلز، سرامیک و کامپوزیت که احتمال آزادسازی ترکیبات با پتانسیل ایجاد شکست DNA دارند
  • نانومواد که در آزمون‌های باکتریایی مانند ایمز قابل ارزیابی نیستند (در این موارد آزمون کومت به عنوان روش ترجیحی توصیه می‌شود)
  • مواد دندانی و ارتودنسی با تماس طولانی با بافت نرم و استخوان
  • محصولات آرایشی بهداشتی و دارویی که نیاز به ارزیابی سمیت ژنی دارند
  • موادی که در آزمون ایمز نتیجه منفی دارند اما مشکوک به سمیت ژنی هستند (آزمون کومت حساسیت بالاتری دارد)

مواد و تجهیزات غیرنیازمند آزمون کومت:

  • تجهیزات پزشکی با تماس سطحی محدود (کمتر از ۲۴ ساعت)
  • تجهیزات پزشکی که قبلاً ترکیبات آنها به عنوان غیر ژنوتوکسیک شناخته شده است

Comet Assay: یک روش الکتروفورز سلول منفرد است که شکست DNA را در سطح سلول‌های منفرد تشخیص می‌دهد. سلول‌های آسیب دیده پس از الکتروفورز ظاهری شبیه دم دنباله‌دار (Comet) پیدا می‌کنند.

Tail DNA: درصد کل DNA مهاجرت کرده به سمت آند (دم) است. این شاخص حساس‌ترین پارامتر برای ارزیابی شکست DNA محسوب می‌شود.

Tail Length: فاصله بین مرکز سر (هسته سلول) تا انتهای دم. این شاخص نشان‌دهنده شدت آسیب DNA است.

Tail Moment: حاصل ضرب طول دم و درصد DNA در دم. این شاخص ترکیبی، آسیب DNA را با دقت بیشتری نشان می‌دهد.

Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE): نام علمی آزمون کومت که بر اساس مهاجرت قطعات DNA شکسته شده در میدان الکتریکی عمل می‌کند.

استاندارد مرجع: OECD 489 (در کنار ISO 10993-3)

نوع روش: کمی – فلوریمتری (الکتروفورز + فلورسانس)

انواع نسخه:

  • نسخه قلیایی (Alkaline Comet Assay): تشخیص شکست DNA تک رشته‌ای و دو رشته‌ای – رایج‌ترین
  • نسخه خنثی (Neutral Comet Assay): تشخیص شکست DNA دو رشته‌ای

رده سلولی: TK6 (سلول لنفوبلاستوئید انسانی)، لنفوسیت انسانی، CHO، V79، سلول‌های بافت هدف (برای نسخه درون تنی)

شرایط انکوباسیون سلول‌ها با ماده: 37 تا 38 درجه سانتی‌گراد، رطوبت، 5% دی اکسید کربن

تیمار کوتاه مدت: 3 تا 6 ساعت (با و بدون S9)

تیمار طولانی مدت: 20 تا 24 ساعت (بدون S9)

فعال کننده متابولیک: مخلوط S9 (10% تا 30%)

زمان و نحوه گواهی و گزارش‌دهی: 6 تا 8 هفته کاری – گزارش کامل نتایج به زبان انگلیسی (قابل دانلود از سایت)

دامنه تشخیص: ارزیابی شکست DNA در سطح سلول منفرد با حساسیت بالا

اصل الکتروفورز سلول منفرد: سلول‌های تیمار شده با ماده آزمون در آگاروز بر روی لام قرار می‌گیرند و سپس لیز می‌شوند تا غشا سلولی و پروتئین‌ها حذف شوند. در این مرحله، DNA در داخل آگاروز باقی می‌ماند.

اصل شکست DNA: در سلول‌های سالم، DNA به صورت سوپرکویل (فوق پیچیده) درآمده و در حفره هسته باقی می‌ماند. در سلول‌های دارای شکست DNA (تک یا دو رشته‌ای)، قطعات DNA از حفره هسته خارج می‌شوند.

اصل مهاجرت در میدان الکتریکی: در هنگام الکتروفورز، قطعات DNA شکسته شده (دارای بار منفی) به سمت آند (قطب مثبت) مهاجرت می‌کنند. سرعت مهاجرت با اندازه قطعات DNA رابطه معکوس دارد (قطعات کوچک‌تر سریع‌تر حرکت می‌کنند).

اصل تصویر دم دنباله‌دار: پس از الکتروفورز و رنگ‌آمیزی با رنگ فلورسنت (مانند DAPI، اتیدیوم بروماید، SYBR Gold)، سلول‌های دارای شکست DNA ظاهری شبیه دم دنباله‌دار (Comet) نشان می‌دهند. سر (Head) هسته اصلی حاوی DNA سالم و دم (Tail) حاوی قطعات DNA شکسته شده است.

اصل حساسیت بالا: آزمون کومت حساس‌ترین روش برای تشخیص شکست DNA است و قادر به شناسایی آسیب‌های DNA در غلظت‌های بسیار پایین (حتی کمتر از 1 شکست به ازای 10^10 دالتون DNA) می‌باشد. برای نانومواد که در آزمون‌های باکتریایی (ایمز) قابل ارزیابی نیستند، این روش به عنوان روش ترجیحی توصیه می‌شود.

تجهیزات اصلی: هود لامینار عمودی، انکوباتور دی اکسید کربن (۳۷-۳۸ درجه، ۵ درصد دی اکسید کربن)، دستگاه الکتروفورز افقی ولتاژ پایین (۰/۵ تا ۱/۵ ولت بر سانتی‌متر)، واحد منبع تغذیه، میکروسکوپ فلورسانس با فیلتر مناسب، دوربین دیجیتال CCD، نرم‌افزار تحلیل تصویر (CometScore، OpenComet)، سانتریفیوژ، حمام آب (۳۷-۳۸ درجه و ۴۵-۵۰ درجه)، فریزر منفی ۸۰ درجه، لام‌های مخصوص کومت، پیپت چند کاناله، هموسایتومتر

مواد مصرفی: رده سلولی (TK6، لنفوسیت انسانی، CHO یا V79)، آگاروز با نقطه ذوب پایین (LMP) و آگاروز معمولی، محیط کشت اختصاصی (RPMI 1640 یا DMEM/F-12H) با ۱۰ تا ۱۵ درصد سرم جنین گاوی، فعال کننده متابولیک S9 (۱۰ تا ۳۰ درصد حجمی)، رنگ‌های فلورسنت (DAPI، اتیدیوم بروماید، SYBR Gold یا SYBR Green)، بافر لیز (NaCl، EDTA، Tris-HCl، تریتون X-۱۰۰)، بافر الکتروفورز قلیایی (NaOH، EDTA، pH ۱۳)، بافر خنثی‌کننده (Tris-HCl، pH ۷/۵)، بافر شستشو (PBS استریل)، کنترل منفی (نرمال سالین، DMSO، محیط کشت)، کنترل مثبت (MMS، H2O2)

ابتدا نمونه مطابق با ISO 10993-12 آماده می‌شود. عصاره‌گیری در حلال‌های قطبی (نرمال سالین، محیط کشت بدون سرم) و غیرقطبی (DMSO، روغن کنجد) انجام می‌شود. نسبت سطح به حجم عصاره گیر (معمولاً 3 سانتی‌متر مربع به ازای هر میلی‌لیتر برای پلاستیک‌ها و 0/1 گرم به ازای هر میلی‌لیتر برای مواد دیگر) رعایت می‌گردد. عصاره گیری در دمای 37 تا 38 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 تا 72 ساعت انجام می‌شود. رقت‌های سریال از عصاره تهیه می‌شود (حداقل 3 غلظت قابل تجزیه و تحلیل).

آماده‌سازی لام: لام‌های میکروسکوپی معمولی با آگاروز معمولی (0/5% تا 1%) پوشانده می‌شوند و خشک می‌گردند. این لایه پایه به عنوان چسبنده برای لایه آگاروز بعدی عمل می‌کند.

کشت سلولی و تیمار: سلول‌ها (TK6 یا لنفوسیت انسانی) در فلاسک T-75 در محیط کشت مناسب در انکوباتور (37 تا 38 درجه سانتی‌گراد، 5% دی اکسید کربن) کشت داده می‌شوند. سلول‌ها به مدت 3 تا 6 ساعت (با و بدون S9) یا 20 تا 24 ساعت (بدون S9) در معرض ماده آزمون (عصاره با رقت‌های مختلف) قرار می‌گیرند.

لایه آگاروز حاوی سلول: پس از تیمار، سلول‌ها با تریپسین (برای سلول‌های چسبنده) یا سانتریفیوژ (برای سلول‌های سوسپانسیون) جمع‌آوری می‌شوند. سلول‌ها با آگاروز با نقطه ذوب پایین (LMP) (0/5% تا 1%، دمای 40 درجه سانتی‌گراد) مخلوط شده و بر روی لایه پایه ریخته می‌شوند. این لایه با یک لام شیشه‌ای یا روکش دیگر پوشانده می‌شود و به مدت 20 تا 30 دقیقه در 4 درجه سانتی‌گراد قرار می‌گیرد تا آگاروز سفت شود.

لیز سلولی: پس از سفت شدن آگاروز، لام‌ها در بافر لیز (دمای 4 درجه سانتی‌گراد) به مدت 1 تا 24 ساعت غوطه‌ور می‌شوند تا غشا سلولی و پروتئین‌ها حذف شده و DNA در داخل آگاروز باقی بماند.

الکتروفورز: لام‌ها در بافر الکتروفورز قلیایی (pH 13) به مدت 20 تا 40 دقیقه قرار می‌گیرند تا DNA باز شده و قطعات DNA آماده مهاجرت شوند. سپس الکتروفورز با ولتاژ پایین (0/5 تا 1/5 ولت بر سانتی‌متر) به مدت 20 تا 40 دقیقه انجام می‌شود. در این مرحله، قطعات DNA شکسته شده به سمت آند مهاجرت می‌کنند.

خنثی‌سازی و رنگ‌آمیزی: پس از الکتروفورز، لام‌ها در بافر خنثی‌کننده (0/4 مولار Tris-HCl، pH 7/5) به مدت 5 تا 15 دقیقه شسته می‌شوند. سپس لام‌ها با رنگ فلورسنت (مانند DAPI، اتیدیوم بروماید، SYBR Gold) به مدت 5 تا 10 دقیقه رنگ‌آمیزی می‌شوند.

تصویربرداری و آنالیز تصویر: لام‌ها زیر میکروسکوپ فلورسانس با بزرگنمایی 200 تا 400 برابر بررسی می‌شوند. حداقل 100 تا 200 سلول منفرد (در هر غلظت) تصویربرداری می‌شوند. سپس نرم‌افزار تحلیل تصویر (مانند Comet Assay IV، CometScore، OpenComet) پارامترهای زیر را اندازه‌گیری می‌کند:

  • درصد DNA در دم (Tail DNA %)
  • طول دم (Tail Length)
  • لحظه دم (Tail Moment) = طول دم × درصد DNA در دم
  • لحظه دم اولیوه (Olive Tail Moment)

نتیجه آزمون بر اساس درصد DNA در دم (Tail DNA %) یا لحظه دم (Tail Moment) در هر غلظت و مقایسه با کنترل منفی (حلال) تعیین می‌شود. همچنین سمیت سلولی (زنده مانی سلول‌ها پس از تیمار) برای هر غلظت محاسبه می‌شود:

نتیجه وضعیت معیار پذیرش (طبق OECD 489)
غیر ژنوتوکسیک منفی  درصد DNA در دم یا لحظه دم در محدوده کنترل منفی است (معمولاً درصد DNA در دم کمتر از 10% تا 15%)
ژنوتوکسیک مثبت افزایش وابسته به غلظت (دوز-پاسخ) و از نظر آماری معنی‌دار (p < 0.05) در درصد DNA در دم یا لحظه دم، با افزایش حداقل 2 تا 3 برابر نسبت به کنترل منفی

  • نکته مهم ۱: سمیت سلولی نباید بیش از 50% (زنده مانی کمتر از 50%) باشد، در غیر این صورت غلظت تست غیرقابل قبول است (آسیب DNA ممکن است ناشی از نکروز باشد و نه اثر مستقیم ماده).
  • نکته مهم ۲: درصد DNA در دم (Tail DNA%) حساس‌ترین و قابل اعتمادترین پارامتر است و در OECD 489 به عنوان پارامتر اصلی برای ارزیابی معرفی شده است.
  • نکته مهم ۳: نسخه قلیایی (Alkaline Comet Assay) قادر به تشخیص شکست DNA تک رشته‌ای و دو رشته‌ای است و رایج‌ترین نسخه مورد استفاده می‌باشد.
  • نکته مهم ۴: نتایج مثبت در آزمون کومت معمولاً نیاز به تأیید با یک آزمون دیگر (مانند OECD 487 – ریزهسته برون تنی) دارند.

حساس‌ترین روش برای تشخیص شکست DNA:
این آزمون حساس‌ترین روش موجود برای ارزیابی شکست DNA در سطح سلول منفرد است. قادر به شناسایی آسیب‌های DNA در غلظت‌های بسیار پایین‌تر از سایر روش‌ها (مانند OECD 473 و OECD 487) می‌باشد. برای نانومواد که در آزمون‌های باکتریایی (ایمز) قابل ارزیابی نیستند، این روش به عنوان روش ترجیحی توصیه می‌شود.

پیش‌بینی سرطان‌زایی و جهش‌زایی:
شکست DNA یکی از مهمترین شاخص‌های سرطان‌زایی بالقوه مواد است. آزمون کومت قادر به تشخیص آسیب‌های DNA ناشی از عوامل کلستوژنیک (شکست مستقیم DNA) و آنیوژنیک (تداخل دوک میتوزی) می‌باشد. این روش به دلیل توانایی در تشخیص آسیب DNA اولیه قبل از تقسیم سلولی، در مطالعات مکانیسم‌شناسی بسیار ارزشمند است.

الزامات قانونی سازمان غذا و دارو:
سازمان غذا و داروی ایران، سی اف دی ای (NMPA)، FDA و MHRA انجام آزمون کومت (OECD 489) را برای تمامی تجهیزات پزشکی با تماس طولانی مدت و ایمپلنت به عنوان بخشی از باتری سمیت ژنی الزامی می‌دانند. از آنجا که هیچ آزمون واحدی قادر به شناسایی همه عوامل ژنوتوکسیک نیست، انجام یک باتری از آزمون‌ها (شامل OECD 489) ضروری است.

تفاوت با OECD 471 (آزمون ایمز): آزمون ایمز جهش‌های نقطه‌ای را در باکتری‌ها تشخیص می‌دهد و برای تشخیص شکست DNA مناسب نیست. آزمون کومت شکست DNA را در سطح سلول منفرد پستانداران تشخیص می‌دهد. هر دو مکمل یکدیگر هستند. برای نانومواد که در آزمون ایمز قابل ارزیابی نیستند، کومت به عنوان روش ترجیحی توصیه می‌شود.

تفاوت با OECD 473 (انحراف کروموزومی) و OECD 487 (ریزهسته): آزمون‌های انحراف کروموزومی و ریزهسته آسیب کروموزومی را پس از تقسیم سلولی (در متافاز یا اینترفاز) تشخیص می‌دهند. آزمون کومت شکست DNA را در سطح رشته (تک و دو رشته‌ای) و در سلول‌های غیر تقسیم شونده تشخیص می‌دهد. کومت به تقسیم سلولی نیاز ندارد و برای بافت‌هایی با میزان تقسیم پایین مناسب است.

تفاوت با OECD 476 (HPRT) و OECD 490 (MLA): آزمون‌های HPRT و MLA جهش‌های ژنی را در سطح مولکولی (توالی DNA) تشخیص می‌دهند. آزمون کومت شکست DNA فوری را تشخیص می‌دهد (قبل از اینکه سلول فرصت ترمیم را داشته باشد). کومت قادر به تشخیص آسیب‌های ترمیم پذیر است در حالی که آزمون‌های جهش ژنی آسیب‌های ترمیم ناپذیر (جهش) را ثبت می‌کنند.

مزیت اصلی روش OECD 489: این روش حساس‌ترین روش موجود برای تشخیص شکست DNA است، نیاز به تقسیم سلولی ندارد (بر خلاف OECD 473/487)، قادر به تشخیص آسیب DNA اولیه قبل از ترمیم است، به تعداد کم سلول نیاز دارد (تا 1000 سلول)، و برای نانومواد (که در آزمون‌های باکتریایی قابل ارزیابی نیستند) به عنوان روش ترجیحی توصیه می‌شود.

  • مشخصات دقیق نمونه (توضیحات فنی، شماره لات، تاریخ تولید)

  • شرایط عصاره گیری (نسبت سطح به حجم، حلال، دما، زمان) مطابق با ISO 10993-12

  • رده سلولی استفاده شده (نوع، منبع، پاساژ سلول)

  • شرایط تیمار (زمان، با/بدون S9، غلظت‌ها)

  • نسخه آزمون (Alkaline Comet Assay / Neutral Comet Assay)

  • نتایج سمیت سلولی (زنده مانی) برای تعیین محدوده غلظت‌های غیرسمی

  • غلظت‌های تست شده عصاره (حداقل 3 غلظت قابل تجزیه و تحلیل)

  • نتایج کنترل‌های منفی (محدوده کنترل تاریخی درصد DNA در دم)

  • نتایج کنترل‌های مثبت (درصد DNA در دم، تأیید حساسیت سیستم)

  • تعداد سلول‌های بررسی شده (حداقل 100 تا 200 در هر غلظت)

  • درصد DNA در دم (Tail DNA%) برای هر سلول (میانگین ± انحراف معیار) در هر غلظت

  • طول دم (Tail Length) برای هر غلظت (میانگین ± انحراف معیار)

  • لحظه دم (Tail Moment) برای هر غلظت (میانگین ± انحراف معیار)

  • لحظه دم اولیوه (Olive Tail Moment) در صورت محاسبه

  • هیستوگرام توزیع سلول‌ها بر اساس درصد DNA در دم

  • تصاویر فلورسانس از سلول‌های کنترل منفی، کنترل مثبت و نمونه

  • نتیجه آزمون در شرایط با S9 و بدون S9

  • طبقه‌بندی نهایی: منفی / مثبت

  • مهر تایید و امضای مدیر فنی

آیا گزارش آزمون کومت آزمایشگاه سنجش ساناژن برای اخذ تاییدیه سازمان غذا و داروی ایران کافی است؟

بله، آزمایشگاه سنجش ساناژن به عنوان آزمایشگاه همکار رسمی سازمان غذا و داروی ایران با شماره پروانه فعالیت 901864051216296 و دارای گواهی ISO 17025 و رعایت اصول GLP می‌باشد. گزارش‌های صادره مستقیماً برای اخذ پروانه ساخت، کد آی آر سی و تاییدیه نهایی قابل ارائه هستند. با این حال، طبق ISO 10993-3، از آنجا که هیچ آزمون واحدی قادر به شناسایی همه عوامل ژنوتوکسیک نیست، یک باتری حداقلی شامل OECD 471 (آزمون ایمز) + OECD 489 (کومت) یا OECD 473/487 الزامی است.

آیا تست سمیت ژنی کومت برای نانومواد قابل استفاده است؟

بله، آزمون کومت برای نانومواد که در آزمون‌های باکتریایی مانند ایمز (OECD 471) قابل ارزیابی نیستند، به عنوان روش ترجیحی و توصیه شده است. به دلیل اینکه نانومواد ممکن است نتوانند به داخل باکتری نفوذ کنند یا با دیواره سلولی باکتری تداخل داشته باشند، آزمون کومت (در سلول‌های پستانداران) گزینه مناسب‌تری است.

تفاوت بین نسخه قلیایی (Alkaline) و خنثی (Neutral) کومت چیست؟

  • نسخه قلیایی (Alkaline Comet Assay): از بافر الکتروفورز با pH 13 استفاده می‌شود که قادر به تشخیص شکست DNA تک رشته‌ای و دو رشته‌ای است. این نسخه حساس‌ترین است و رایج‌ترین نسخه مورد استفاده می‌باشد.
  • نسخه خنثی (Neutral Comet Assay): از بافر الکتروفورز با pH خنثی (حدود 7) استفاده می‌شود که فقط شکست DNA دو رشته‌ای را تشخیص می‌دهد. حساسیت کمتر اما اختصاصیت بالاتری برای آسیب‌های کلستوژنیک دارد.

OECD 489 هر دو نسخه را مجاز می‌داند، اما نسخه قلیایی به دلیل حساسیت بالاتر توصیه می‌شود.

چرا از دو برنامه تیمار (کوتاه و طولانی)  در تست سمیت ژنی کومت استفاده می‌شود؟

  • برنامه تیمار کوتاه مدت (3 تا 6 ساعت) با و بدون S9 برای شناسایی مواد ژنوتوکسیک با اثر مستقیم و مواد پیش ژنوتوکسیک (نیازمند متابولیسم) استفاده می‌شود.
  • برنامه تیمار طولانی مدت (20 تا 24 ساعت) بدون S9 برای شناسایی موادی استفاده می‌شود که نیاز به زمان بیشتری برای اعمال اثر خود دارند (مانند مواد با جذب سلولی آهسته، مهارکننده‌های سنتز DNA، یا موادی که باعث استرس اکسیداتیو می‌شوند).

معیار پذیرش کنترل مثبت و منفی  در تست سمیت ژنی کومت چیست؟

  • کنترل منفی (حلال): درصد DNA در دم (Tail DNA%) باید در محدوده کنترل تاریخی آزمایشگاه باشد (معمولاً کمتر از 10% تا 15%). درصد DNA در دم بالاتر نشانگر آلودگی یا آسیب مکانیکی DNA در هنگام آماده‌سازی نمونه است.
  • کنترل مثبت (MMS یا H2O2): باید باعث افزایش وابسته به غلظت و معنی‌دار آماری (p < 0.05) در درصد DNA در دم شود (معمولاً 30% تا 70%). عدم افزایش کافی نشانگر کاهش حساسیت سیستم است و آزمون باید تکرار شود.

آیا برای محصولات صادراتی به چین (CFDA/NMPA) گزارش آزمون کومت شما پذیرفته می‌شود؟

بله، گزارش‌های آزمایشگاه سنجش ساناژن با رعایت الزامات ISO 17025 و GLP و استناد به ISO 10993-3 و OECD 489، برای ثبت محصولات در بازار چین (NMPA) قابل ارائه می‌باشد. NMPA رسماً دستورالعمل OECD 489 را به عنوان یک روش معتبر برای ارزیابی شکست DNA می‌پذیرد.

چه موادی با آزمون کومت تداخل دارند؟

مواد با سمیت سلولی بالا (زنده مانی کمتر از 50%) که باعث افزایش درصد DNA در دم (ناشی از نکروز) می‌شوند. مواد فلورسنت ذاتی (که در طول موج رنگ‌های فلورسنت تداخل دارند). مواد رنگ‌زا (که با رنگ‌های فلورسنت تداخل دارند). موادی که با آگاروز واکنش می‌دهند. در این موارد استفاده از غلظت‌های پایین‌تر یا شستشوی اضافی سلول‌ها قبل از تهیه لام توصیه می‌شود.

زمان انجام آزمون کومت چقدر است؟

زمان انجام آزمون معمولاً 6 تا 8 هفته کاری از تاریخ دریافت نمونه تا صدور گزارش نهایی می‌باشد. این زمان شامل عصاره گیری (1 تا 3 روز)، کشت سلولی و تیمار (2 تا 3 روز)، لیز و الکتروفورز (1 روز)، رنگ‌آمیزی و تصویربرداری (1 روز)، آنالیز تصویر (100 تا 200 سلول در هر غلظت) (5 تا 10 روز)، تأیید نتایج (در صورت نیاز، تکرار آزمایش) و تهیه گزارش است. آنالیز تصویر (Comet Scoring) زمانبرترین بخش آزمون است.

آیا می‌توانم همزمان سایر آزمون‌های زیست‌سازگاری را نیز سفارش دهم؟

بله، آزمایشگاه سنجش ساناژن کل سری استاندارد ISO 10993 شامل سمیت سلولی (ISO 10993-5)، حساسیت‌زایی (ISO 10993-10)، تحریک‌پذیری (ISO 10993-10)، سمیت سیستمیک (ISO 10993-11)، هموکمپاتیبلیتی (ISO 10993-4)، ایمپلنت (ISO 10993-6) و سایر آزمون‌های سمیت ژنی (OECD 471, 473, 476, 478, 487, 490) را نیز ارائه می‌دهد. انجام همزمان آزمون‌ها باعث کاهش زمان و هزینه می‌شود.

چه تفاوتی بین آزمون کومت و آزمون ریزهسته از نظر تشخیص “آسیب اولیه” و “آسیب ترمیم ناپذیر” وجود دارد؟

  • آزمون کومت شکست DNA اولیه را بلافاصله پس از تیمار (قبل از اینکه سلول فرصت ترمیم را داشته باشد) تشخیص می‌دهد. این روش آسیب‌های ترمیم پذیر و ترمیم ناپذیر را ثبت می‌کند.
  • آزمون ریزهسته (OECD 487) آسیب ترمیم ناپذیر (ریزهسته) را پس از تقسیم سلولی تشخیص می‌دهد. سلول‌ها فرصت ترمیم دارند و فقط آسیب‌هایی که ترمیم نشده‌اند به ریزهسته تبدیل می‌شوند.
  • آزمون کومت برای غربالگری سریع و تشخیص آسیب اولیه مناسب است، در حالی که آزمون ریزهسته برای تایید آسیب پایدار (بعد از ترمیم) استفاده می‌شود.

برای مشاوره رایگان و هماهنگی ارسال نمونه، با کارشناسان ما تماس بگیرید.

 پیام‌رسان بله: 989900100182+

 تماس تلفنی: 982191010809+

  • تست سمیت-ژنی-کامت اسی
  • تست سمیت ژنی comet assay
  • تست سمیت ژنی کومت اسی

تکمیل و ارسال کلیه مدارک و فرم‌های مورد نیاز پیش از ارسال نمونه به آزمایشگاه الزامی است. لطفاً مدارک را به‌صورت کامل و صحیح ارسال نمایید. در صورت وجود نقص یا مغایرت در اطلاعات، فرآیند پذیرش نمونه، بررسی فنی و شروع آزمون با تأخیر مواجه خواهد شد.

مدارک مورد نیاز قبل از ارسال نمونه به آزمایشگاه

پیش از ارسال نمونه، لطفاً الزامات و شرایط حمل، نگهداری و بسته‌بندی نمونه را به دقت مطالعه نموده و جهت اطمینان از پذیرش صحیح نمونه، با واحد پذیرش آزمایشگاه هماهنگی لازم را انجام دهید.

شرایط ارسال نمونه به آزمایشگاه

جهت دریافت هزینه دقیق و به‌روز آزمون‌ها، لطفاً فرم درخواست آزمون را از طریق پیام‌رسان بله یا ایمیل برای آزمایشگاه ارسال نمایید. درخواست شما توسط کارشناسان فنی بررسی شده و هزینه نهایی بر اساس نوع آزمون، تعداد نمونه‌ها و الزامات مطالعه اعلام خواهد شد.

استعلام هزینه آزمون

گزارش نهایی آزمون پس از تکمیل تمامی مراحل آزمایش، بررسی نتایج و تأیید واحد کنترل کیفیت، در کوتاه‌ترین زمان ممکن صادر شده و حداکثر ظرف 10 روز کاری در قالب گزارش رسمی انگلیسی به متقاضی تحویل خواهد شد.

گزارش نهایی آزمون